Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/11455/13861
DC FieldValueLanguage
dc.contributor.advisor毛嘉洪zh_TW
dc.contributor.advisorFrank Chiahung Maoen_US
dc.contributor.author陳柏文zh_TW
dc.contributor.authorChen, Po Wenen_US
dc.date2004zh_TW
dc.date.accessioned2014-06-06T06:51:23Z-
dc.date.available2014-06-06T06:51:23Z-
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11455/13861-
dc.description.abstract乳鐵蛋白為哺乳動物體內存有的天然抗菌蛋白。為解決畜牧現場的細菌抗藥性問題,所以進行乳鐵蛋白的抗菌功能及其應用之研究。首先,為了構築更強效的抗菌蛋白,利用疏水性和鹼性胺基酸與抗菌活性有關之概念,合成不同胺基酸序列的牛乳鐵蛋白衍生片段,研究構築更強效抗菌蛋白的可能性,並探討與抗菌活性有關的胺基酸序列。先合成牛乳鐵蛋白N端的20至29序列(bLf 20-29),並將其上所有的鹼性胺基酸以精胺酸或離胺酸替代;另將bLf 20-29上所有的非鹼性胺基酸以色胺酸、苯丙胺酸或異白胺酸替代。結果顯示,所合成的蛋白片段均有不等的抗菌活性,而精胺酸、離胺酸、色胺酸、苯丙胺酸和異白胺酸均與蛋白片段的抗菌活性有關。為了進一步產製抗菌蛋白以臨床運用,利用牛乳鐵蛋白素能抗高溫高壓滅菌而仍具抗菌活性之特點,建立了大腸桿菌表現系統以表現牛乳鐵蛋白素融合蛋白。欲待大量產製融合蛋白後,再經高溫高壓滅菌而直接應用於臨床。然而,所表現的融合蛋白本身及其經不同蛋白酶截切後的蛋白水解液均無抗菌活性。因此,另以容易取得之牛乳鐵蛋白為研究對象,研究牛乳鐵蛋白水解液與不同抗菌機制的抗生素併用後,對抗藥性大腸桿菌株的抗菌活性。結果發現,合併使用牛乳鐵蛋白水解液與gentamicin、cephalothin、cefamandole或rifampicin後,對抗藥性大腸桿菌菌株具有部分協同的抑制生長效果;而合併使用牛乳鐵蛋白水解液與rifampicin後,對抗藥性大腸桿菌株具有協同的殺菌效果。這些發現也許能解決臨床上常見之細菌抗藥性問題,並提供細菌感染的新治療方式。另一方面,目前並無可靠的方法可用以診斷乳羊的非臨床性乳房炎。因此本研究亦建立乳鐵蛋白的酵素連結免疫分析法,用以研究羊乳中的乳鐵蛋白濃度與乳品質或乳房感染的相關性。經檢測正常桶羊乳後發現,羊乳中的乳鐵蛋白濃度與其美藍還原試驗(methylene blue reduction test)所需時間成負相關性;當桶羊乳的美藍試驗時間為大於8小時、介於5至8小時或小於5小時時,其乳中的平均乳鐵蛋白濃度分別為167、218和304 g/ml。此外,美藍還原試驗時間大於8小時之桶羊乳,其乳中的乳鐵蛋白濃度顯著低於試驗時間小於8小時之桶羊乳。另外,由臨床上個別乳和四頭羊的動物實驗可知,臨床性乳房炎和潛在性乳房炎乳中的乳鐵蛋白濃度均顯著高於正常乳中的濃度。而於動物實驗中,當四頭羊的其中一個乳分房接種金黃色葡萄球菌後,乳中乳鐵蛋白濃度可從低於30 g/ml(第1天)迅速升高為1000 μg/ml (第4天)。於第4天後,乳鐵蛋白濃度逐漸下降,並維持100至300 g/ml至第14天。而對照組乳中的乳鐵蛋白濃度於實驗進行期間均低於100 μg/ml。此外,實驗組乳中的乳鐵蛋白濃度於第3天後均顯著高於對照組乳中的濃度。由此可知,乳中的乳鐵蛋白濃度變化與乳品質或乳房之細菌感染有關,所以羊乳中的乳鐵蛋白濃度變化或能作為乳品質之指標。zh_TW
dc.description.abstractLactoferrin is a natural antibacterial protein in mammals. To deal with the antibiotic-resistant bacteria infection in the fields, the antibacterial activity and the availability of this protein was studied. To design short and potent analogs of bovine lactoferricin, several peptides were synthesized using the concepts of lipophilic bulk and cationic charge. Thus, basic residues of bovine lactoferricin (bLf 20-29; residues 20 to 29) were modified by substitution with arginine or lysine and nonbasic residues were modified by substitution with tryptophan, phenylalanine, or isoleucine. Peptides were evaluated by determining their minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) against Escherichia coli, Staphylococcus aureus, and Enterococcus faecalis. It was observed that all synthesized peptides possessed different potency of antibacterial activity against selected bacterial strains. Thus, the arginine, lysine, tryptophan and isoleucine residues were all related to the antibacterial potency of antibacterial peptides. Moreover, bovine lactoferricin has been found to retain the antibacterial potency after sterilization by autoclave. Thus, an E. coli expression system was established to express a large quantity of bovine lactoferrin fusion protein. The expressed protein was intended to be sterilized by autoclave and be applied in fields directly. However, this protein and its protease hydrolyse showed no antibacterial activity. Since bovine lactoferrin is easily available, the antibacterial activity of lactoferrin hydrolysate in combination with antibiotics of different antibacterial mechanisms was studied. Partial synergy of growth-inhibitory activity between bLf-lysate with the gentamicin, cephalothin, cefamandole and rifampicin against antibiotic-resistant E. coli strains was found and synergistic bactericidal activity against the antibiotic-resistant E. coli strains when bLf-lysate was combined with rifampicin. These findings could be used to solve the antibiotic-resistant bacteria problem in fields. Presently, there is no reliable method to detect subclinical mastitis in dairy goats. Thus, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was established to detect the lactoferrin concentration (LFC) in goat milk. The relationship between the variation of LFC in milk and milk quality or intramammary infection was investigated. The results indicated that the LFC in bulk milk negatively correlate to the methylene blue reduction test (MBRT) time of milk. Moreover, the mean LFC in bulk milk of more than 8 hours, 5 to 8 hours or below 5 hours of MBRT time was 167, 218 or 304 g/ml, respectively. The mean LFC in milk of more than 8 hours of MBRT time was significantly lower than that of below 8 hours of MBRT time. Otherwise, the LFC in clinical and subclinical mastitic milk was observed to be significantly higher than that in normal milk. In animal model (4 goats), one of the healthy udder halves (totaled four) of each goat was inoculated with Staphylococcus aureus. The daily LFC of the infected milk increased from below 30 μg/ml (day 1) to 1000 μg/ml (day 4) and then gradually decreased to 100 to 300 μg/ml (day 10), where it remained at this level till the end of experiment (14 day). In contrast, daily LFC in control milk were below 100 μg/ml during the experiment. Moreover, the LFC was significantly higher in infected milk than that in normal milk after day 3. Since milk LFC was found to be associated with the milk quality or intramammary infection, it may be used as an index for intramammary infection in goats.en_US
dc.description.tableofcontents中文摘要 I 英文摘要 III 目 錄 V 圖目錄 X 表目錄 XI 第1章 前 言 1 第2章 文獻探討 4 2-1 乳鐵蛋白簡介 4 2-2 乳鐵蛋白之結構 5 2-3 乳鐵蛋白之分佈與表現 8 2-4 乳鐵蛋白之功能 10 2-4-1 抑制微生物生長 10 2-4-1-1 抑制細菌生長 10 2-4-1-2 抑制病毒生長 13 2-4-1-3 抑制寄生蟲生長 15 2-4-1-4 抑制黴菌生長 15 2-4-2 抑制腫瘤細胞生長 16 2-4-3 免疫調節作用 18 2-4-3-1 乳鐵蛋白對免疫細胞增生之影響 18 2-4-3-2 乳鐵蛋白對免疫細胞分化之影響 19 2-4-3-3 乳鐵蛋白對細胞性免疫反應之影響 19 2-4-3-4乳鐵蛋白對體液性免疫反應之影響 20 2-5 抗炎症反應作用 21 2-6 乳鐵蛋白之其他功能 22 2-6-1 轉錄因子功能 22 2-6-2核醣核酸酶功能 23 2-6-3抗血液凝集功能 23 2-6-4絲胺酸蛋白酶(serine proteinase) 23 2-7 乳鐵蛋白之表現 24 2-8 乳房炎 25 2-8-1 乳房炎定義 25 2-8-2 乳房炎之分類 25 2-8-3 乳房炎對乳品質及乳產量之影響 26 2-8-4 乳房炎診斷 26 2-8-4-1 細菌學檢查(bacteriological examination) 27 2-8-4-2 體細胞計數法(somatic cell counts) 28 2-8-4-3 加州乳房炎試驗法(California mastitis test, CMT) 30 2-8-4-4 電導度檢測法 31 2-8-4-5 乳中成份之改變 32 第3章 乳鐵蛋白素之抗菌活性分析 35 3-1 前 言 35 3-2 材料與方法 37 3-2-1 抗菌蛋白 37 3-2-2 細菌菌株 39 3-2-3 抗菌蛋白之抗菌活性檢測 39 3-3 結果 40 3-3-1 乳鐵蛋白素衍生蛋白片段的抗菌活性 40 3-3-2 牛乳鐵蛋及其水解液之抗菌活性 40 3-3-3 短蛋白片段的抗菌活性 42 3-4 討 論 45 3-5 總 結 49 第4章 乳鐵蛋白素的表現 50 4-1 前 言 50 4-2 材料與方法 51 4-2-1 製備牛乳鐵蛋白素基因 51 4-2-2 純化質體DNA 53 4-2-3 構築牛乳鐵蛋白素表現載體 54 4-2-3-1 核酸限制酶截切質體及基因片段 54 4-2-3-2 DNA接合反應 54 4-2-3-3 載體轉型和勝任細胞製備 55 4-2-4 載體轉型及表現 56 4-2-5 大量表現牛乳鐵蛋白素融合蛋白及蛋白純化 57 4-2-6 抗菌活性分析 59 4-2-7 胃蛋白酶截切表現用宿主 60 4-3 結 果 61 4-3-1 牛乳鐵蛋白素基因確認 61 4-3-2 表現載體構築與確認 63 4-3-3 融合蛋白於不同宿主中之表現情形 66 4-3-4 表現蛋白之純化及其產量 68 4-3-5 表現蛋白的抗菌活性分析 70 4-3-6 胃蛋白酶截切表現用宿主之蛋白電泳結果 71 4-4 討 論 72 4-5 總 結 75 第5章 乳鐵蛋白水解液與抗生素併用之抗菌活性分析 76 5-1 前 言 76 5-2 材料與方法 78 5-2-1 抗生素 78 5-2-2 細菌菌株 79 5-2-3 抗菌蛋白 80 5-2-4 抗菌活性檢測 80 5-2-5 協同試驗 81 5-3 結 果 82 5-3-1 抗菌劑之抗菌活性 82 5-3-2 抗生素與牛乳鐵蛋白水解液併用後之抗菌結果 83 5-3-3 抗生素與牛乳鐵蛋白水解液之最佳組合 87 5-4 討 論 89 5-5 總 結 92 第6章 羊乳乳鐵蛋白濃度與乳品質之相關性 94 6-1 前 言 94 6-2 材料與方法 95 6-2-1 乳樣本採集 95 6-2-2 羊乳鐵蛋白純化 95 6-2-3 生物素聯結體製備 97 6-2-4 建立競爭型酵素連結免疫分析法 98 6-2-5 酵素連結免疫分析法之靈敏度及平行試驗測試 98 6-2-6 競爭型酵素連結免疫分析法 99 6-2-7競爭型酵素連結免疫分析法之分析內與分析間變異係數 99 6-2-8 美藍還原試驗 100 6-2-9 乳脂率、酸度及乳比重 100 6-2-10 統計分析 100 6-3 結 果 101 6-3-1 以膠體過濾法純化羊乳鐵蛋白之結果 101 6-3-2 以親和性樹脂從羊初乳中純化乳鐵蛋白之結果 102 6-3-3 平行試驗及標準曲線 103 6-3-5 羊乳中乳鐵蛋白濃度 106 6-3-6 羊乳之乳脂率、酸度及比重 108 6-3-7 乳中乳鐵蛋白濃度與美藍還原試驗時間之相關性 108 6-4 討 論 109 6-4-1 羊乳鐵蛋白純化 109 6-4-2 羊乳乳中成份之檢測 113 6-5 總 結 116 第7章 以動物實驗模式研究羊乳中乳鐵蛋白濃度之變化 117 7-1 前 言 117 7-2 材料與方法 119 7-2-1 實驗動物與羊乳樣本 119 7-2-2 乳鐵蛋白濃度及其他乳中成份之檢測 119 7-2-3 統計分析 120 7-3 結果 120 7-3-1 乳中乳鐵蛋白濃度變化 120 7-3-2 乳中體細胞數目變化 121 7-3-3 乳中的加州乳房炎試驗結果和生菌數數目變化 122 7-3-4 乳產量、乳蛋白和乳脂率 124 7-3-5 乳鐵蛋白與乳中變數之相關係數 125 7-4 討 論 128 7-5 總 結 130 第8章 結論與建議 131 參考文獻 134 附錄一 勝任細胞製備和載體轉形 160 附錄二 西方墨點法(Western blotting) 162 附錄三 蛋白質透析 164 附錄四 各大腸桿菌宿主的基因型別(genotype) 165 附錄五 牛乳鐵蛋白素融合蛋白之核酸定序結果 166 附錄六 膠體過濾法(gel filtration) 168 附錄七 羊乳鐵蛋白之競爭型酵素連結免疫分析法 170 附錄八 抗體製備方法 172zh_TW
dc.language.isoen_USzh_TW
dc.publisher獸醫學系zh_TW
dc.subjectlactoferrinen_US
dc.subject乳鐵蛋白zh_TW
dc.subjectlactoferricinen_US
dc.subjectmastitisen_US
dc.subject乳鐵蛋白素zh_TW
dc.subject乳房炎zh_TW
dc.title乳鐵蛋白之抗菌功能及其在乳房炎檢測之應用zh_TW
dc.titleAntibacterial Activity of Lactoferrin and Its Application in Detection of Mastitisen_US
dc.typeThesis and Dissertationzh_TW
Appears in Collections:獸醫學系所
文件中的檔案:

取得全文請前往華藝線上圖書館



Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.