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標題: 應用間接酵素結合免疫吸附法(ELISA)測定家禽流行性感冒血清抗體
Development and evaluation of indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detecting avian influenza antibody
作者: 黃文徹
HUANG, WEN-CHE
關鍵字: 間接酵素
免疫吸附法
家禽流行性感冒
血清抗體
出版社: 獸醫研究所
摘要: 家禽流行性感冒病毒具有13種hemagglutin 抗原亞型和9 種neuraminidase 抗原亞 型,而且由於其遺傳基因體的特殊構造,在自然界,本病毒極易發生突變而產生新 的亞型,因此傳統抗體監測均以瓊膠沈澱反應 (agar gel precipitation test, AGP test) 找出抗體陽性的血清之後,再以血球凝集抑制反應(Hemagglutination inhibition test, HI test) 來鑑定其血清亞型,測試相當繁雜,且其敏感度較低 ,極待改進。本研究即針對此進行建立酵素結合免疫吸附法(ELISA) ,以期對本病 有一特異性與敏感性高之抗體監測系統。 本試驗以AI病毒H5N9株接種SPF雞胚,採集病毒增殖之尿液,經超高速離心濃縮100 -200倍後,再以二次蔗糖濃度20﹪-60﹪連續梯度超高速離心,在40﹪處得明顯濃 縮病毒帶,其病毒蛋白質含量可達28.2mg/ml,HA力價達105.5/50ul,感染 力價達1011.3 EID50/ml 。此純化病毒以負染色在電子顯微鏡下觀察為 很純的完整病毒顆粒聚集,極少雜質,再以 SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide) 電泳分析,具6種病毒結構蛋白質,即P3,P1,P2,HA,NA及NP 等。 經比較試驗此純化之AIV 顆粒,以disruption buffer 處理,將病毒封套游離,再 以含牛血清白蛋白之PBS 稀釋,應用於ELISA 比僅以完整病毒顆粒或僅以PBS 當稀 釋液其效果較佳。 利用已知陽性及陰性血清作橫盤式力價測定來決定抗原,Conjugate 和Substrate 在ELISA 測定時之最適當濃度,依Sign to noise ratio (S/N 值=陽性血清OD值 /陰性血清OD值)最高判定,抗原最適濃度為 1ug/well, Conjugate 為 1/20 , Substrate 以25ug/well 最理想。 隨機採樣之雞血清90支,以上述最適濃度之抗原, Conjugate 和 Substrate 進行 ELISA 測定,該血清也進行AGP 和HI te 抗體價在4倍以上者有63支,AGP 陽性者 僅4支,其HI抗體價在128 倍以上;而HI抗體價8倍以上之血清,在ELISA 有62﹪ 呈陽性反應,HI抗體價16倍以上之血清,在ELISA 則100﹪ 呈陽性,雖在ELISA 測 定時,各血清以100 倍稀釋其敏感性和特異性較理想。
URI: http://hdl.handle.net/11455/14086
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