Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/11455/20899
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dc.contributor.advisor楊明德zh_TW
dc.contributor.advisorMing-Te Yangen_US
dc.contributor.authorshieh, Sheau-yannen_US
dc.contributor.author謝小燕zh_TW
dc.date2000zh_TW
dc.date.accessioned2014-06-06T07:14:48Z-
dc.date.available2014-06-06T07:14:48Z-
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11455/20899-
dc.description.abstractThe level of gene expression is tightly coupled to the metabolic and environmental status of the cell. This is achieved primarily by regulation at the transcription level. RNA polymerases of eubacteria are essential component of the transcriptional apparatus. They are multiple subunits enzymes composed of a, b, b¢, and s subunit. The s subunit of RNA polymerase confers to core enzyme the specificity to initiate transcription. We have previously cloned and sequenced the rpoH gene encoding the s32 of Xanthomonas campestris pv. campestris strain 11 (Xc11). Interestingly, a putative sE-type promoter was recognized at the regulatory region of the X. campestris rpoH gene. The presence of this heat shock sigma factor (sE) in X. campestris and the expression of rpoE gene at normal growth temperature and under heat shock conditions were investigated in this study. Two degenerated oligonucleotides, SigE-N and SigE-C, which correspond to the conserved regions of RpoE were designed and used in polymerase chain reaction. The 300-bp PCR amplification product was then used as probe to select rpoE-containing l phages from the constructed Xc11 genomic library. After conducting in vivo excision, three pBK-CMV derivated phagemids were generated and designated as pBK-CMV1A3, pBK-CMV5B, and pBK-CMV6A3, respectively. Restriction map and Southern blot analysis indicated that the 1.5-kb EcoRI-EcoRI fragment of pBK-CMV1A3 containing the intact rpoE gene. The nucleotide sequences on both strands of the 1.5-kb insert were determined. Results of DNA sequence analysis revealed one intact and one incomplete open reading frames (ORF). The first ORF (ORF206) starts at nt 474 (ATG) and ends at nt 1094 (TGA), from which a 206 amino acids with molecular weight of 24 kDa could be translated. The deduced amino acids of ORF206 showed 56% identity with E. coli RpoE. The second ORF begins at nt 1109 and an incomplete 111 amino acids polypeptide could be encoded. The predicated amino acids have 35% identity with the N-terminal region of E. coli RseA protein. The transcriptional start site of ORF206 was determined to locate at 33 nt (G) preceding the ATG start codon by primer-extension. Sequence similar to consensus sE type promoter was observed at the upstream region of the transcriptional start site. Recognition of this promoter by Xc11 RNA polymerase core enzyme reconstituted with Xc11 or E. coli sE could be verified by gel retardation analysis. The effect of heat shock on the level of rpoE expression was analyzed by Northern blot analysis. A small increase in the amount of rpoE mRNA was detectable 40 min after heat shock at 37℃. However, Western blot analysis showed no detectable increase in the level of RpoE during heat shock at 42℃.en_US
dc.description.abstract細胞內基因的表現和其本身的代謝情況與所處的環境狀態有密切的相關性, 其主要的調控是在轉錄作用的階段。 原核生物的 RNA 聚合是轉錄作用時的主要執行者。 它是由多種的次單元酵素,包括 α,β,β''及 σ 所組成,其中 σ 次單元提供 RNA 聚合的核心可專一性地去進行轉錄的起始作用。 本實驗室過去曾對負責轉錄作用的 RNA 聚合各次單元及 sigma 因子的基因進行選殖的工作。 其中,在與熱休克表現有關的 σH 因子基因上游發現有類似 E. coli σE 辨識的起動子序列,且含此啟動子序列的 DNA 模板,可被含有 E. coli σE 因子的 RNA 聚合辨識與結合。 因此推測 X. campestris pv. campestris strain 11 (簡稱Xc11) 菌株內可能含有次要 sigma 因子 σE,並參與調控 rpoH 基因的表現。 本研究即在尋找 Xc11 菌株裡的 rpoE 基因,同時對 rpoE 基因上游的啟動子進行研究分析。 首先,以 RpoE的蛋白保留性區域,設計二條退化性引子,分別命名為 SigE-N 及 SigE-C,進行聚合鏈鎖反應,增幅出 300-bp 的 PCR 產物,接著以此 DNA 片段為探針 (probe),對所構築好的 Xc11 的基因庫進行菌斑雜交法,篩選到包含有rpoE基因的 l 噬菌體,經菌體內質體切割法得到三個衍生的質體,分別命名為 pBK-CMV1A3、pBK-CMV5B 及 pBK-CMV6A3。 進一步以鑑識圖譜及南方墨點法分析,顯示在質體 pBK-CMV1A3 的內嵌約 1.5 kb EcoRI-EcoRI DNA 片段中內包含有完整的 rpoE 基因。 同時完成此 1. 5 kb 片段雙股 DNA 的核酸定序工作。由 DNA 序列分析結果顯示,存在一個完整的及一個不完整的 ORF,第一個 ORF (ORF206) 起始於第 474 個核酸 (ATG), 終止於第 1094 個核酸 (TGA),可轉譯出 206 個胺基酸,分 子量為 24 kDa 的蛋白,經比對 ORF206 與 E. coli 的 rpoE 蛋白有 56 % 的相同性。 第二個不完整的 ORF 起始於第 1109 個核酸, 可轉譯出 111 個胺基酸, 它與 E. coli RseA 蛋白 N 端區域有 35 % 的相同性。此外,亦藉由引子延伸反應偵測 ORF206 轉錄作用的起始點,為距離轉譯起始點 ATG 上游第 33 個核酸 2G2 處,並在轉錄起始點上游找到保留性高的 sE-type 啟動子序列。 在啟動子的鑑定方面, 乃是藉由所得之 Xc11 核心與 Xc11 或 E. coli 的sE 因子重組後的 RNA 聚合, 進行 gel-retardation 實驗分析而證實。 並由北方墨點法偵測 rpoE 基因在受到熱休克刺激後的表現情形,結果顯示 rpoE 的 mRNA 在 37 ℃ 熱休克 40 分鐘時, 可偵測到最高的表現量。 然而利用抗RpoE的抗體進行西方墨點分析時發現,Xc11 RpoE 蛋白並不隨著熱休克時間延長而有明顯的變化。zh_TW
dc.description.tableofcontents目 錄 縮寫字對照表‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 1 中文摘要‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 3 英文摘要‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 4 前言‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 5 材料與方法 I. 材料 一、菌種、噬菌體及質體‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 11 二、藥品‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 11 三、酵素‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 12 四、培養液及緩衝溶液‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 12 五、引子‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 12 II. 實驗方法 一、染色體 DNA 之抽取‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 14 二、質體 DNA 之抽取‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 14 三、勝任細胞 (Competent cell) 之製備‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 15 四、聚合連鎖反應 (PCR) ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 15 五、DNA 片段回收 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 15 六、轉形作用 (transformation) ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 16 七、電孔法 (electroporation) ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 16 八、T-vector的製備 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 16 九、DNA探針之製備 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ ‥‥‥‥‥‥‥‥17 十、南方墨點雜交法‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 17 十一、膠體內墨點雜交法‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 18 十二、單一選殖株質體釋出法‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 18 十三、菌種甘油保存法‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 18 十四、限制圖譜 (Restriction map) ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 19 十五、部份刪除殖株 (Deletion clones) 之構築‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 19 十六、DNA 定序模版之製備‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 19 1. 單股 DNA 模板之製備 2. 雙股 DNA 模板之製備 DNA 十七、DNA 定序分析‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 20 1. 一般 DNA 定序反應 (Sanger dideoxy DNA 定序反應) 2. Taq DNA polymerase DNA 定序反應 十八、pETSigENX 蛋白表現質體之構築‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 21 十九、Xc11 RpoE 蛋白之純化‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 22 二十、蛋白質凝膠電泳分析 (SDS-PAGE) ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 22 二十一、西方墨點法 (Western blot) ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 23 二十二、RpoE 抗體之誘發、製備及保存‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 23 二十三、Xc11菌體內 RNA 的純化‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 24 二十四、北方墨點法 (Northern blot) 分析 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 24 1. RNA 洋菜凝膠之製備及電泳 2. RNA 轉印 3. 雜交探針之製備 4. 雜交反應 5. 自動放射顯影 二十五、引子延伸 (primer-extension) ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 25 二十六、體外轉錄 (in vitro transcription) ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 26 二十七、Gel retardation‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 26 二十八、突變株之構築‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 27 1. rpoE 基因片段之定點突變作用 2. 質體 pSKM8、pETM22 及 pETGmM22 之構築 3. 篩選 Xc11 菌體染色體上 rpoE 基因的突變株 二十九、十字花科植物之感染‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 28 三 十、胞外黏多醣之測定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 28 結 果 一、重組質體 pSK-rpoEXcP7 之構築‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 29 二、菌斑雜交法及菌體內質體切割選殖 rpoE 基因‥‥‥‥‥‥‥‥ 30 三、質體 pBK-CMV1A3、pBK-CMV6A3、pBK-CMV5B 內之選殖基因的鑑識圖譜分析‥‥‥30 四、質體 pSK-1A3ER2 及 pSK-1A3ER4 及其刪除株之構築‥‥‥‥ 31 五、DNA 定序分析‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 31 六、北方墨點法及引子延伸法‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 32 七、質體 pETSigENX 之構築及 RpoE 蛋白的大量表現‥‥‥‥‥‥ 33 八、RpoE 蛋白之純化‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 34 九、RpoE 抗體之製備及西方墨點法分析‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 34 十、Xc11 rpoE 基因上游啟動子序列及 RpoE 蛋白之體外活性分析 ‥‥‥35 十一、質體 pSKM8、pETM22、pETGmM22 及 Xc11 rpoE 基因突變株之構築‥‥‥‥35 十二、野生型的Xc11及Xc11 rpoE基因突變株之致病性及胞外多醣測試‥‥‥‥‥‥37 討 論 一、rpoE 基因的選殖‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 38 二、RpoE 蛋白的表現‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 41 三、rpoE 基因上游啟動子序列與 RpoE 蛋白之體外活性分析‥‥‥‥ 42 四、Xc11 突變株之篩選及 rpoE 基因對 Xc11 致病性之探討‥‥‥‥‥ 43 參考文獻‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 45 圖表‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 52 附錄‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 87zh_TW
dc.language.isoen_USzh_TW
dc.publisher分子生物學研究所zh_TW
dc.subjectRNA 聚合zh_TW
dc.subjectrpoEen_US
dc.subject熱休克蛋白zh_TW
dc.subject次要 sigma 因子zh_TW
dc.subjectECFen_US
dc.subjectσEen_US
dc.subjectXanthomonas campestrisen_US
dc.subjectrseAen_US
dc.subjectalgUen_US
dc.subjectrpoHen_US
dc.title十字花科黑腐病菌 rpoE 基因之選殖及其啟動子之探討zh_TW
dc.titleCloning and Promoter Analysis of the rpoE Gene from Xanthomonas campestris pv. campestrisen_US
dc.typeThesis and Dissertationzh_TW
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