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標題: Trigonopsis variabilis D-型氨基酸氧化�@基因在 Escherichia coli的 表現及突變分析 D-型胺基酸氧化 活性相關之胺基酸殘基
Expression of Trigonopsis variabliis D-amino acid oxidase gene in Escherichia coli and mutational anaysis of amino acid residues involved in the catalytic acitivity of D-amino acid oxidase
作者: 傅惠美
Fu, Hui-Mei
關鍵字: 頭孢菌素
轉型菌株
表現載體
D-型胺基酸氧化
D-amino acid oxidase
Cephalosporin C
transformant
expression vector
出版社: 植物學系
摘要: Trigonopsis variabilis 的 D-amino aicd oxidase(EC.1.4.3.3, 以下 簡稱 DAO)可用於生產頭孢菌素類抗生素的先驅物 7- amino- cephalosporanic acid 。此酵素是 flavoprotein,由兩個相同的次單元 (subunit)所組成,且需與 FAD 結合才具有活性。T.variabilis dao 基因長 1,107 bp,並包含一個內子(intron)位於第 25 到 60 bp之間 。將 dao cDNA 基因選殖至表現載體 pET-21b 再轉形入 Escherichia coli BL-21(DE3),以 T7 啟動子控制其表現,在 IPTG誘導之下,其比 活性為 0.3 U/mg,為 T.variabilis CCRC 21509 (基因供給者 ) DAO 活 性的九倍。且 dao 基因於 E.coli BL-21(DE3)表現時,轉形菌株的生 長狀況良好。然而,構築於 pKm-cDAO 上的 dao 基因,於 E.coli DH5α 中表現時,轉形菌株的生長不良。為解決此問題,設計了七種培養基,發 現 LA 培養基添加 L-glutamic aicd 或 D-glutamic acid 時,會大幅提 高pKm-cDAO 對 E.coli DH5α 的轉形效率 transformation efficiency )。然而,對轉形菌株的生長,仍然無明顯的改善。將 dao 基因 構築 於 pALTER-cDAO 上,利用定點突變法,將 DAO 上的 His-324 改變為 Leu-324,發現此種 DAO 的活性消失。顯示 His-324 和 DAO 的活性有關 。將具有不同 DAO活性的質體 pKm-cDAO ,pKm-cDAOm1, pKm-cDAOm2, pTrc-cDAO7 及 pTrc-cDAO28 上的 dao 基因進行核甘酸定序及氨基酸比 對,得到 5 個氨基酸殘基的變異點,這些變異點未來可分別進行定點突 變,以確定這些氨基酸殘基是否確實與 DAO 的活性有關。
URI: http://hdl.handle.net/11455/21087
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