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標題: 十字花科蔬菜黑腐病菌啟動子之選殖分析與泛寄主啟動予選殖載體之構築
作者: 陳熊辰
CHEN, XIONG-CHEN
關鍵字: 十字花科蔬菜
黑腐病菌
啟動子
選殖分析
寄主啟動
出版社: 植物學研究所
摘要: 本實驗採用兩種方法來選殖 Xanthomonas compestris pv. campestris ( Xc ) 染色體的啟動子區域。一為兩選殖法,另一為構築泛寄主的啟動子選殖載體供直接 選殖。 啟動子選殖載 pKM005 以 HindIII 切割後, 用 mung bean nuclease 或 Klenow fragment 處理,切齊或補 HindIII 的 sticky end。 Xc 染色體以 PvuII 切割後與上述的 pM005 粘接,並轉形 E.coli JM103Y。 在 Maconkey plate 挑出 15 個紅色菌落, 分析其 B-gaiatosidase 活性。 隨後與寄主載體 pKMLT 行 in vivo recombination 形成 cointegrate,然後以三親交配的方法送入 Xc 中。 其 轉形株在 X-gal 的培養上皆呈現藍色菌落。 分析七個在 E.coli 中能表現 B-galactosidase 活性之轉殖株的 DNA 序列。 以 mung bean nuclease 處理過的 四個 clones 均無 Xc 染色體片段的插入的 DNA 片段分為 227bp ( E8 ),34bp ( E10 )與 4bp ( E16 )。 E8 有類似 E.coli 的 -10, -35 consensus sequence 和 ribosome binding site, 也有譯起始 codon ATG 可以和 lacZ in frame。由於 E10 的 insert 序列上無啟動子、ribosome binding site 亦無 ATG 轉譯起始碼,所以其能表現的原因不明。利用上述二段選殖法得到的 Xc 轉形株攜 帶的質體非常大,不分析。 本研的一工作為構築泛寄主啟動子選殖載。供直接篩選 promoter region 於 Xc。 以 pRK415 的衍生質體 pFJ2 為主體, 刪除與複製無關的 DNA 序列後, 得到一 5.5Kb 的泛寄主載體 pHC1。pHC1 加入多重選殖座後,接入 pKM005 之 lac ZY 基 因為報導基因。 為防止上游的啟動子 read through, 在 lac 基因上游接上一個 Thra terminator, 此質體命名為 pNT。 pNT 可以經由電孔法送入 E.coli 和 Xc 中,其轉形株皆能抗四環徽素。帶有 pNT 的 Xc 轉形株在 X-gal plate 上不會形 成藍色菌落但 E.coli 轉形株的菌落皆為藍色, 意味在 Xc 與 E.coli 的轉譯 / 轉錄系統或與 lac 基因表現有關的背景有很大的差異。 #9203440 #9203440
URI: http://hdl.handle.net/11455/21372
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