Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/11455/23755
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dc.contributor.advisor張功耀zh_TW
dc.contributor.advisorKung-Yao Changen_US
dc.contributor.author嚴正其zh_TW
dc.contributor.authorYen, Jen-Chien_US
dc.date2001zh_TW
dc.date.accessioned2014-06-06T07:21:06Z-
dc.date.available2014-06-06T07:21:06Z-
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11455/23755-
dc.description.abstractCREB是個轉錄活化因子,它參與了由各種訊號傳遞路徑所啟動的基因表現,並且體內許多的生理功能都能被它所調控。CREB會藉由其b-zip (basic region leucine zipper) domain以二聚體(dimmer)的形式透過leucine repeats 形成一個coiled coil 的結構來與CRE(cAMP response element) DNA產生結合,或是b-zip直接以兩個單體(monomers)的形式,依序各別與CRE DNA產生結合,然後兩個與CRE結合的b-zip單體再組成二聚體,進而活化轉錄作用。 p53在細胞中也是個轉錄活化因子,它扮演著調節細胞內某些重要的機制,例如:停止細胞生長(cell cycle arrest)與細胞的計劃性死亡 (apoptosis)。而這些轉錄活性都與他抑制腫瘤的功能有關。p53能轉譯出一段長393個胺基酸的蛋白質,此蛋白包含了三個功能區域,分別是transactivation domain(a.a 1-73)、DNA binding domain(a.a 102-292)、tetramerization domain(a.a 323~356)及nuclear localization domain(a.a 363~393)。根據最近的研究指出p53的amino terminus可以透過protein-protein interaction和CREB的b-zip domain直接的產生交互作用。 而本研究要探討的是在(1)in vitro的情況下p53 transactivation domain與b-zip protein是否會有直接的交互作用?以及(2) p53對於b-zip與CRE之間的結合力是否有影響?如果有,又是以什麼樣的作用機制所造成?以及在結構上是否具有未知的變化。 根據我所做的實驗結果顯示,在in vitro中,p53 transactivation domain不會與b-zip蛋白有直接的結合作用,但從EMSA的競爭實驗中卻得到His-p53會增加b-zip蛋白與CRE DNA產生結合的量。zh_TW
dc.description.tableofcontents壹、中文摘要……………………………………………………….4 貳、英文摘要……………………………………………………….5 參、前言……………………………………………………….……6 肆、實驗藥品及材料 實驗菌種及載體…………………………………………………11 實驗方法 一. PCR based 的策略合成全長的基因………………………11 二. 從cDNA library以PCR的方式合成出所要的DNA片段……………………………………………………………12 三. 各個基因片段蛋白質表現質體的構築與轉型 1. 含p53 transactivation domain DNA片段, CREB DNA binding domain b-zip(basic region leucine zipper) DNA及MDM2 p53 binding domain DNA表現質體的構築………………………………………………………..13 2. 含rat CREB full sequence DNA片段及表現質體的構築………………………………………………………..13 四. 各個蛋白質的表現與純化(expression and purification) 1. p53 transactivation domain蛋白,b-zip(basic region leucine zipper)蛋白及MDM2 p53 binding domain蛋白的表現和純化……………………………………………………..14 2. Rat CREB蛋白的表現和純化…………………………15 五. 蛋白質定量分析……………………………………………16 六. CRE (cAMP response element)DNA(21 base pair palindrome)及mutant CRE(mtCRE) DNA 5’端γ-32P ATP放射性同位素標定………………………………………………………….16 七. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)……………….17 八. 西方點墨法(western blotting)………………………………17 九. GST-pull down assay………………………………………..18 伍、結果 一. PCR based 基因的合成…………………………………….20 二. GST-tagged及His-tagged蛋白的大量表現及純化………..22 三. 以GST-pull down的方法檢視在in vitro 情況下p53 transactivation domain (1~73)不會與b-zip蛋白產生交互作用…………………………………………………………….25 四. 透過Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)證明b-zip對CRE DNA結合的功能…………………………………..27 五. p53 activation domain(1~73)會增加b-zip蛋白與CRE DNA的結合……………………………………………………….29 陸、討論………………………………………………………….…31 柒、附錄一A……………………………………………………….32 附錄一B………………………………………………………..36 附錄二………………………………………………………….37 捌、參考文獻……………………………………………………….42 玖、附圖 一. Structure domain of CREB...………………………………….6二. b-zip與CRE crystal structure…………………………………7三. Structure domain of p53.…..………………………………..….9四. PCR based DNA的合成……………………….………..…..21伍. 蛋白質的表現和純化……..………………………………..23六. 各個His-tagged及GST-tagged的純化蛋白…….….….…24七. GST pull down………..………………….……………….…26 八. b-zip對CRE DNA的結合功能及專一性…..…….……….28 . 九. p53對b-zip蛋白與CRE DNA結合能力的影響………....30zh_TW
dc.language.isoen_USzh_TW
dc.publisher生物化學研究所zh_TW
dc.subject轉錄活化因子zh_TW
dc.subjectp53en_US
dc.subjectb-zipen_US
dc.titlep53對b-zip蛋白之DNA結合能力影響的探討zh_TW
dc.titlecan b-zip DNA-binding activity be modulated by p53en_US
dc.typeThesis and Dissertationzh_TW
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