Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/11455/51019
標題: 微生物尿酸氧化酵素之生產及其應用之研究
Studies on production and application of microbial uricase
作者: LI, GING-FU
李清福
關鍵字: 微生物
尿酸
酵素
尿酸氧化酵素
出版社: 食品科技研究所
摘要: 微生物尿酸氧化酵素是細胞內誘導酵素,主催化尿酸至囊素之反應,該酵素可用於製 備臨床用酵素套組以檢驗尿液或血液中之尿酸含量,本研究主要目的在於培養微生物 生產酵素以製備酵素套組並進行評估試驗,主要內容包括菌株之改良與篩選,最佳培 養條件之探討,抽取方法之比較,酵素之純化和性質之測定,酵素套組之製備及其評 估。 自菌種保存機構搜集之多株Candida utilis篩選出酵素生產力較強NRRIY-900菌株 。其100毫升培養液和每克濕菌體(水分含量約為75%)之酵素活性分別為23 .6和2.73單位。此菌株再經nitrosoguanidine(NG)誘導變異後於存活株中篩 選得酵素生產力最高之CT-762菌株。產量約為野生株之150%。其最適之培養 基成份和培養修件如下:以4%蔗糖,1%酵母抽出物,0.8%尿素,0.3%硫 酸銨,0.05%硫酸鎂,0.2%磷酸二鈉,pH6.5之生長培養基中培養CT-7 62菌株24小時後,離心所得之菌體再於1%蔗糖,0.04%尿酸,0.01% 黃嘌呤,0.3%磷酸二鈉,0.1%氯化鉀,0.05%硫酸鎂,pH7.8之誘導 培養3小時後,每100毫升培養液和每克濕菌體之酵素活性分別為52.6和5. 46單位,為野生株之2.3倍。酵素抽取之試驗結果以鹼性自家消化法最佳。利用 5升之發槽需經40小時之菌體培養,再經3小時之酵素誘導。其酵素產量與三角瓶 規模相較稍差。 粗酵素以0.2%protamine sulfate去除核酸後,再經DEAE-cellulose 管柱色層分 析,Sephadex G -200膠體過濾,最後純化倍數為22倍,活性回收率約75%。 純化後酵素性質如:最適作用pH為8.0,最適作用溫度為40℃,Kn值為3.79 ×10M/min,其專一性基質為尿酸,Hg和Zn對酵素有強烈抑制作用, 而Ca,Mg則有活化效果,該酵素為一硫醇酵素,易受PCMB,KCN ,HgCl影 響而失去活性,而還原劑如glutathionc,cysteine,NaBH等之添加,可使之回復 活性。 以UV及可見光吸光法兩種原理製備兩類酵素套組,其配方分別為:⑴UV吸光法酵素套 組:50mM之硼酸緩衝液(pH8.5)中含0.069U/ml 尿酸氧化酵素,以此為 測定液,而測定稀釋液為50mM硼酸緩衝液。⑵可見光吸光法酵素套組:測定液中各 藥劑之濃度分別為尿酸氧化酵素0.0875U/ml,過氧化酵素。0.75U/ml, 3.5-dichloro-2-hydrpxybenzene sulfonic acid 3.5mM,4-aminoantipyr- ine 0.5mM硼酸組衝液(pH8.5)。此二大類酵素套組中之尿酸氧化酵分別以三 種不同純度之酵素配製,並以手工法和自動分析法進行評估試驗,評估之項目包括尿 酸基質直線分析,精確度,比較試驗及穩定性等試驗。其中所有酵素套組其直線相關 係數皆趨近於1.0,精確度之偏差係數皆在所要求之5%以下,穩定性在30℃下 至少可達8小時,於2-8℃下至少8天。而比較試驗以統計分析結果得知,所有之 酵素套組無論以手工法或自動分析法進行分析,其結果皆無不規則誤差。由上各試驗 得知,本研究中所配製之酵素套組其可接受性良好。
URI: http://hdl.handle.net/11455/51019
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