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標題: Design, synthesis, expression and purification of recombinant Ganoderma lucidum immunomdulatory protein Ling ZHi-8 derivative functional peptides in Bacillus subtilis and Escherichia coli
靈芝免疫調節蛋白質及其衍生功能性胜肽之設計、合成並於大腸桿菌及枯草桿菌中表現純化
作者: Lin, Ming-Yi
林明義
關鍵字: 生物活性胜肽
bioactive peptides
降膽固醇胜肽
融合蛋白質
雙體結構
高效能液相層析
hypocholesterolemic peptide
fusion protein
dimmer structure
HPLC
出版社: 食品暨應用生物科技學系
摘要: 近幾年來,許多具有生物活性功能的胜肽(Bioactive peptides)已陸續從各種不同的蛋白質食品中被分離出來,包括;抗氧化胜肽(antioxidant peptide) 、降膽固醇胜肽(hypocholesterolemic peptide) 等等,從牛奶中所取得之抗氧化胜肽不僅可以防止酵素性及非酵素性氧化反應、與抗氧化劑如BHA、BHT 混合後更具有協同的作用;從大豆蛋白中所取得之降膽固醇胜肽 I-I-A-E-K 更被證實具有活化cholesterol 7α-hydroxylase gene 的表現。傳統上欲獲得生物活性胜肽,是將含此胜肽之蛋白質進行酵素水解後純化所得,隨著科技發展與生物活性胜肽價值的提高,人工合成胜肽的技術也逐漸成熟。目前胜肽合成方式可分為三種:化學合成法,酵素合成法及基因重組法。本論文則嘗試利用基因重組方式來生產生物活性胜肽。 本實驗室先前成功於 GRAS (generally recognized as safe)級之菌種中表現重組靈芝免疫調節蛋白質 rLZ-8,且經體外證實具有免疫調節之活性;為了成功表現生物活性胜肽,因此本實驗利用遺傳工程技術將欲表現之三重複降膽固醇胜肽及抗氧化胜肽基因序列以OE-PCR的方式接續於SLZ-8基因之3’端,並於rLZ-8及短胜肽之間插入 trypsin 、pepsin 及chymotrypsin之切位,而後利用 B. subtilis WB800 及 E. coli BL21為表現宿主進行融合蛋白之表現生產。 實驗中成功構築出五個表現質體 pOASLZFC 、 pOASLZFCO、 pETLZFC 、 pETLZFCO 及 pETSLZFCO 以 B. subtilis WB800 為宿主可分泌融合蛋白質 rLZFC 約達8.9mg/L 之產量;所表現之融合蛋白質 rLZFCO 則可能遭受枯草桿菌蛋白酶分解,以西方墨點法配合His tag 抗體無法觀察到表現。在以 E. coli BL21(DE3)為宿主的蛋白表現中, rLZFC 與 rLZFCO 皆可利用 IPTG 進行誘導表現。融合蛋白質特性分析方面,由大腸桿菌所表現之融合蛋白質 rLZFC,經 trypsin 水解之後即可藉由交聯試劑觀察到雙體結構,且水解之產物,由高效能液相層析 (HPLC) 分析證實與化學合成法所得之標準品為同ㄧ物質。由此可知,融合蛋白質具有 rLZ-8 與生物活性胜肽兩部份,因此,本研究所設計之融合蛋白質具有開發成預防保健食品之潛力。
URI: http://hdl.handle.net/11455/51103
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