Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/11455/57446
標題: 新穎基因篩選標記及其應用
作者: 許文輝
陳怡潔
出版社: 分子生物學研究所
摘要: 本發明由土壤多元基因體中,選殖出離胺酸消旋化酶(lyr)基因,其轉譯出的產物離胺酸raceamse(Lyr),具有生物轉換能力,將L-離胺酸轉換成D-離胺酸或將D-離胺酸轉換成L-離胺酸。利用本發明所選殖的lyr基因,取代抗藥性基因作為篩選標記,以D-離胺酸或L-離胺酸作為唯一氮源,進行植物基因轉殖。使用菸草(Nicotiana benthamiana Domin.)為模式植物,已成功的完成基因轉殖。本發明所選殖的lyr基因,將可替代抗藥性基因,作為基因改造植物在基因選殖時之非抗藥性篩選標記,廣泛被使用於對D-離胺酸或L-離胺酸敏感的植物。 The invention discloses the novel selectable marker gene from metagenomic library, lyr, encoding lysine racemase (Lyr) that can catalyze the racemization of L- to D- lysine or D- to L- lysine. When D- lysine or L- lysine is used as sole nitrogen source, lyr gene instead of drug-resistant gene can be used as a selectable marker for the genetic transformation of plants. The marker gene has been successfully used in the transformation ofNicotiana benthamiana Domin, a model organism for transgenic plants. Our data indicated that the lyr gene can be used as selectable marker for the transformation of plants which are susceptible to D- or L-lysine. 【創作特點】 本發明的目的,係利用消旋化酶的生物轉換特性,催化胺基酸之消旋化作用,轉換質子的移動,產生不同旋光性,利用不同旋光性的氨基酸作為基因改造植物生長時的抑制劑。 為達成本發明的前述目的,本發明係相關於一種經分離之基因篩選標記,其編碼包含SEQ ID NO.1或其簡併序列;較佳的是,該簡併序列與SEQ ID NO.1具有60%至99%的相似性。 較佳的是,該核酸分子轉錄SEQ ID NO.4蛋白;更較佳的是,SEQ ID NO.4蛋白具有離胺酸消旋酶的活性。 本發明另相關於一種重組載體,其係包含如申請專利範圍第1項所請之基因篩選標記,及一調控序列;較佳的是,該調控序列為CaMV 35S(cauliflower mosaic virus promoter)。 本發明另相關於一種含有前述之重組載體之微生物;較佳的是,該微生物係為農桿菌或農桿根瘤菌或大腸桿菌;更佳的是,該微生物為寄存於食品工業發展研究所之寄存編號BCRC 940520之大腸桿菌。 本發明另相關於一種生產離胺酸消旋酵素的方法,其係包括培養前述所請微生物以分離純化離胺酸消旋酵素;較佳的是,該微生物係為大腸桿菌。 較佳的是,分離純化之方法係以管柱層析進行。 本發明另相關於一種生產含有前述所請之篩選標記之生物的方法,其係包括:提供含有將申請專利範圍第7至9項所請之微生物導入生物細胞中,搭配以D-或L-離胺酸作為氮源的MS培養基共同培養;在含有D-或L-離胺酸作為氮源的培養基上,篩選轉殖成功的生物細胞或組織或癒傷組織。 較佳的是,微生物係為農桿菌及農桿根瘤菌;更佳的是,該微生物為寄存於食品工業發展研究所之寄存編號BCRC 940520之大腸桿菌。 較佳的是,該生物細胞其係為對L-離胺酸或D-離胺酸敏感之細胞。 較佳的是,培養基係為MS培養基。 本發明另相關於一種具有SEQ ID NO.4序列之蛋白質,其表現離胺酸消旋酵素之活性。 較佳的是,該蛋白質之最適反應緩衝液為Tris-HCl緩衝液(pH 7.0至9.0);更較佳的是,該蛋白質之最適反應溫度為25~40℃。 較佳的是,該蛋白質在含有二價金屬離子之溶液下展現酵素活性;最佳的是,該蛋白質在含有2mM選自包含Zn 2+ 、Co 2+ 及Mg 2+ 所組成之二價金屬離子族群的溶液下展現酵素活性,且其活性大小依序為Co 2+ >Mn 2+ >Ni 2+ 。
URI: http://hdl.handle.net/11455/57446
文章連結: http://twpat.tipo.gov.tw/tipotwoc/tipotwkm
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