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dc.contributor.advisor謝快樂zh_TW
dc.contributor.advisorHappy K Shiehen_US
dc.contributor.author李敏旭zh_TW
dc.contributor.authorLee, Min-Shiuhen_US
dc.date1999zh_TW
dc.date.accessioned2014-06-09T09:31:17Z-
dc.date.available2014-06-09T09:31:17Z-
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11455/66289-
dc.description.abstract中 文 摘 要 此實驗應用聚合連鎖反應作為快速檢測之技術,以應用在家禽流行性感冒臨床病例之快速診斷;首先我們於具有高保留性之核蛋白基因上設計出用來檢測A型流行性感冒病毒之通用性引子,經以此技術應用於家禽流行性感冒之種毒株及由野鳥分離之病毒株,結果均可以準確的檢出;而因家禽流行性感冒病毒與新城雞病病毒所造成之病害十分相似,故參考先前已設計用來偵測NDV之引子配合偵測家禽流行性感冒病毒之引子,發展單管多引子之RT-PCR使之能同時偵測家禽流行性感冒病毒與新城雞病病毒。進一步為了區別新城雞病病毒疫苗株與野外病毒株之混淆,我們亦參考先前已發表之台灣地區新城雞病野外病毒株序列,設計出用來檢測野外病毒株之引子,並應用在進行單管多引子RT-PCR中,經以動物試驗進行檢出效果評估,具有可應用於臨床檢測之適用性,作為快速區別家禽流行性感冒病毒或新城雞病病毒之感染。 為了能快速的檢出AIV感染及區分出其血清亞型,我們針對每一種HA與NA亞型之基因設計出一對具特異性之引子,以供作為以RT-PCR區分血清亞型之用,在HA亞型方面,由目前所有各亞型已公開之基因序列設計出之引子,應用於已知亞型之病毒株及由野鳥所分離之病毒株之亞型區分上,並將產物以定序後確認之,結果均可區分出病毒之血清亞型;而在NA亞型方面,由於目前對於其基因序列的研究只偏重在N1、N2亞型,能供作我們進行分析設計引子之基因序列的資訊相當少,所以設計引子之通用性也相對的受到限制,在應用上效果並不佳。 對於台灣地區所分離之AIV,雖有分離到H7亞型之病毒株,但目前並未發現有具高病原性之病毒株,而從家禽中只分離到2株H6N1亞型病毒株,其均屬於低病原性毒株,在臨床上均無引起明顯之症狀;而就基因族譜之分析上,在核蛋白基因分析上,確認為禽源之毒株,在宿主性及地域性上與雁鴨分離株和香港97年H5N1分離株有相近之關係。zh_TW
dc.description.abstractAbstract This study uses RT-PCR for the rapid identification of avian influenza virus (AIV) in clinical cases. We designed a pair of universal primers according to the conserved sequences of the viral nucleoprotein gene. This pair of primers was able to amplify specific PCR products from standard AIV strains and viruses isolated from free-living birds. Because the clinical symptoms of AIV are very similar to those of Newcastle virus (NDV), we developed a multiplex RT-PCR procedure to identify and differentiate AIV and NDV in a single PCR reaction. This multiplex RT-PCR procedure could also differentiate vaccine strains of NDV from field isolates. Experiments using chickens inoculated with AIV and NDV showed that the multiplex RT-PCR could serve as a rapid diagnostic procedure for AIV and NDV. For rapid typing and subtyping of AIV, we designed a pair of specific primers for each HA subtype and NA subtype. For the HA subtyping, the primers we designed were based on the published nucleotide sequences of the HA genes. We found that RT-PCR using these primers could correctly subtype all the standard AIV strains and viruses tested. For the NA subtyping, because only very limited numbers of NA gene sequences are published, the primers we designed gave unsatisfied results in NA subtyping of AIV strains tested. Though the H7 subtype viruses were isolated in Taiwan, they are not highly virulent strains. The two H6N1 viruses we isolated from chickens are also low pathogenic strains, and produced no apparent symptom. Phylogenetic analysis based on the nucleoprotein sequences revealed that viruses of avian origins are closely related to viruses isolated from anatidae in term of host specificity, and are closely related to H5N1 viruses isolated in Hong Kong in term of geographic distribution.en_US
dc.description.tableofcontents目 錄 頁數 中文摘要 I 英文摘要 Ⅱ 表次 Ⅵ 圖次 Ⅶ 第一章 緒言 1 第二章 文獻探討 2 第一節 歷史背景 2 第二節 病毒性狀 4 一、病毒特性 4 二、病毒形態 4 三、病毒結構及功能 5 四、病毒的複製 9 五、病毒物理化學特性 11 六、病毒生物學特性 11 第三節 宿主 13 第四節 病毒之命名 15 第五節 家禽流行性感冒之診斷 16 一、由病原直接證實家禽流行性感冒存 16 (一) 病毒分離同定 16 (二) 直接證實病毒之存在:電子顯微鏡觀察 17 (三) 證實病毒蛋白之存在:免疫螢光試 17 (四) 證實病毒核酸之存在 17 二、由家禽流行性感冒特異性抗體證實感 18 (一)瓊脂沈澱反應 18 (二)血球凝集抑制試驗 19 (三)神經胺酸抑制試驗 19 (四)酵素結合免疫吸附法 20 (五)其它方法 20 第六節 血清亞型之區分方法 20 一、HA亞型之區分 20 (一) 血球凝集抑制試驗 20 (二) 酵素結合免疫吸附法 20 二、NA亞型之區分 21 (一)神經胺酸抑制試驗 21 第七節 實驗室病原性之評估 21 ㄧ、病原性之評估 21 (一) 靜脈內接種病原指數 (Intravenoua pathogenicity index;IVPI) 21 (二) 腦內接種病原指數 (Intracerebral pathogenicity index;ICPI) 21 (三)細胞培養中添加或未添加Trypsin與病毒斑大小之關係 21 二、強毒型家禽流行性感冒之確認 22 第八節 聚合連鎖反應的背景資料 22 第三章 材料與方法 26 第一節 試驗材料 26 一、病毒來源 26 二、實驗動物 27 第二節 試驗方法 27 一、病毒增殖 27 二、病毒分離 28 三、病毒核酸的萃取 28 四、聚合連鎖反應人工引子與反應條件的設計 29 五、反轉錄-聚合連鎖反應產物的確認 37 六、引子敏感度及特異性試驗 38 七、動物試驗 39 八、單管多引子RT-PCR偵測家禽流行性感冒及新城雞病病毒 41 九、利用RT-PCR區分家禽流行性感冒病毒HA亞型 41 十、利用RT-PCR區分家禽流行性感冒病毒NA亞型 41 十一、野外分離株之亞型區分 41 十二、由檢體直接區分其血清亞型 42 十三、野外分離株之病原性及基因分析 42 第四章 結果 44 第一節 病毒增值 44 第二節 病毒核酸之純化 44 第三節 以RT-PCR偵測家禽流行性感冒病毒 44 第四節 動物檢出試驗 45 第五節 單管多引子RT-PCR偵測家禽流行性感冒及新城雞病 46 第六節 病毒分離 49 第七節 利用RT-PCR區分家禽流行性感冒病毒HA亞型 49 第八節 利用RT-PCR區分家禽流行性感冒病毒NA亞型 50 第九節 野外分離株之亞型區分 51 第十節 由檢體直接區分其血清亞型 52 第十一節 野外分離株之病原性及基因分析 55 第五章 討論 67 參考文獻 78zh_TW
dc.language.isoen_USzh_TW
dc.publisher獸醫微生物學研究所zh_TW
dc.subjectAvian Influenzaen_US
dc.subject家禽流行性感冒zh_TW
dc.subjectNewcastle Diseaseen_US
dc.subjectreverse transcription-polymerase chain reactionen_US
dc.subject新城雞病zh_TW
dc.subject反轉錄聚合鏈反應zh_TW
dc.title應用反轉錄聚合鏈反應診斷家禽流行性感冒病毒及區分血清亞型zh_TW
dc.titleDiagnosis and Subtyping of Avian Influenza virus by Reverse Transcription-en_US
dc.typeThesis and Dissertationzh_TW
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