Cloning and Expression of the D-hydantoinase Gene from Agrobacferiun tumefaciens and Characterization of the Enzyme

Abstract

比對已知的D-hydantoinase基因的高保留區域，根據其DNA 序列設計引子，Agroba cferiun tumefaciens 的染色體作為模版，利用聚合晦鏈鎖反應，可以合成一DNA 片段。以此片段作為探針(Probe) ，於A. tumrfaciens的染色體基因庫，以南方墨 點法(Southem blot)篩選出五個含有D-hydantoinase基因的純株(clone) 。分析含 D-hydantoinase基因片段的核甘酸序列，發現嵌入片段含有一個open reading fra me (ORF)。將此段ORF 選殖入Escherichiacoli 菌體內，可表現D-hydantoinase的 活性。此ORF 全長為1,455bp ，可轉譯出含486 個胺基酸殘基的蛋白質、其分子量 為53kDa 。經過胺基酸殘基序列的比對，A. tumefacigns的D-hydantoinase與其他 的D-hydantoinase相似度介於45~50%之間。 將A. tumfaciens 的D-hydantoinase基因選殖入E. coli 表現載體pET-21b 及PQE- 30中，探討D-hydantoinase在E. coli 的最佳生產條件。本研究發現，在接種7 小 時後加入1mM 的IPTG，再於30°C 培養9 個小時，此時的D-hydmtoinase 活性最高 ，可以達到65U/1 。 純化A. tumefaciens D-hydantoinase 酵素，探討其酵素特性，發現在Mn2+離子存 在時，會提高D-hydantoinase的活性，而Cu2+離子則會抑制酵素活性。酵素的最適 反應溫度為60°C ，最適反應pH為9。A. tumrfaciens 的D-hydantoinase酵素有很 強的基質選擇性，對於5,L6-dihydrouracil及D,L-methyl-hydantoin的催化活性較 高，而對於hydantoin、D,L-benzyl-hydantoin 及D,L-p-hydroxyphenyl-hydantoi n 則較低。D-hydantoinase置於 50 °C 保存5 天，尚具有30% 酵素活性。以1M的 H2O2處理D-hydantoinase 10 分鐘後，D-hydantoinase尚保有80% 的活性。