Trigonopsis variabilis D-型氨基酸氧化�@基因在 Escherichia coli的 表現及突變分析 D-型胺基酸氧化 活性相關之胺基酸殘基

Abstract

Trigonopsis variabilis 的 D-amino aicd oxidase（EC.1.4.3.3, 以下 簡稱 DAO）可用於生產頭孢菌素類抗生素的先驅物 7- amino- cephalosporanic acid 。此酵素是 flavoprotein，由兩個相同的次單元 （subunit）所組成，且需與 FAD 結合才具有活性。T.variabilis dao 基因長 1,107 bp，並包含一個內子（intron）位於第 25 到 60 bp之間 。將 dao cDNA 基因選殖至表現載體 pET-21b 再轉形入 Escherichia coli BL-21（DE3），以 T7 啟動子控制其表現，在 IPTG誘導之下，其比 活性為 0.3 U/mg，為 T.variabilis CCRC 21509 (基因供給者 ) DAO 活 性的九倍。且 dao 基因於 E.coli BL-21（DE3）表現時，轉形菌株的生 長狀況良好。然而，構築於 pKm-cDAO 上的 dao 基因，於 E.coli DH5α 中表現時，轉形菌株的生長不良。為解決此問題，設計了七種培養基，發 現 LA 培養基添加 L-glutamic aicd 或 D-glutamic acid 時，會大幅提 高pKm-cDAO 對 E.coli DH5α 的轉形效率 transformation efficiency ）。然而，對轉形菌株的生長，仍然無明顯的改善。將 dao 基因 構築 於 pALTER-cDAO 上，利用定點突變法，將 DAO 上的 His-324 改變為 Leu-324，發現此種 DAO 的活性消失。顯示 His-324 和 DAO 的活性有關 。將具有不同 DAO活性的質體 pKm-cDAO ，pKm-cDAOm1， pKm-cDAOm2， pTrc-cDAO7 及 pTrc-cDAO28 上的 dao 基因進行核甘酸定序及氨基酸比 對，得到 5 個氨基酸殘基的變異點，這些變異點未來可分別進行定點突 變，以確定這些氨基酸殘基是否確實與 DAO 的活性有關。