Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/11455/21271
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dc.contributor.advisor翁淑芬zh_TW
dc.contributor.author陳芝融zh_TW
dc.contributor.authorChen, Chiy-Rongen_US
dc.contributor.other中興大學zh_TW
dc.date2007zh_TW
dc.date.accessioned2014-06-06T07:15:31Z-
dc.date.available2014-06-06T07:15:31Z-
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11455/21271-
dc.description.abstractAbstract Fortheen Stenotrophomonas maltophilia lytic phages (named ΦSMA1 ~ ΦSMA8, Smp14, Smp36, Smp54, Smp104, ΦSMC14 and ΦSMC36) from sewage samples of varions hospitals were isolated. One of them, Smp14, carrying the best effect to lyse various strain of S. maltophilia cells was characterized. The results of electron microscopy showed that the morphology of Smp14 is similar to the members of family Myoviridae. We estimated that Smp14 has a genome size of about 160 kb by using PFGE analysis. Smp14 DNA is refractory to digestion by many restriction endonucleases except MseI. HPLC analysis results showed that phage Smp14 DNA contained A, T, C, G, m4C and two types of unknown modified deoxynucleosides otherthan m5C nor m6A. Purified phage DNA was used for genome sequencing via shotgun cloning strategy and primer walking. Phage Smp14 genome consists of 159,910 bp with a G + C content of 54%. It encodes 230 putative protein-encoding open reading frames (ORFs). Of the total 230 ORFs, 70 were similar to known proteins, 40 were similar to hypothetical proteins. The analyzed results showed that Smp14 genome contains 20 tRNA genes. The structural gene cluster and replication-recombination gene cluster of phage Smp14 showed the same organization with that of T4, and phylogentic analysis based on GP23 classified Smp14 into a novel single-membered T4-type subgroup. Smp14 genome has nucleotide metabolism-related genes but not nucleotide-modification gene. In addition, Smp14 genome contains 32 putative late promoters which are possibly recognized by phage-encoded T4-type σ factor. By RT-PCR analysis, we identified two late promoters which are located upstream of gp4 and gp48. Studying on Smp14 proteome, the results of GP23 N-terminal sequencing showed that Smp14 GP23 has different post-translational processed products. The MALDI-TOF data also showed that the protein modification mechanism maybe exist, causing the formation of various GP23 isoforms.en_US
dc.description.abstract中文摘要 我們從不同醫院之廢液樣品中分離到14株可以感染Stenotrophomonas maltophilia之噬菌體,分別命名為 ΦSMA1 ~ ΦSMA8、Smp14、Smp36、Smp54、Smp104、ΦSMC14和 ΦSMC36,其中以溶裂型噬菌體 Smp14殺菌力最強。於電子顯微鏡下觀察Smp14外型,為屬於噬菌體分類中的Myoviridae。利用PFGE電泳分析Smp14基因體,得知其基因體大小約160 kb。Smp14 DNA除了可被限制酶MseI切割外,對其他多種限制酶具抗性。利用HPLC分析 Smp14 DNA上所包含鹼基種類,發現除了A、T、C、G和m4C外,另含有2種未知形式修飾之鹼基(非m5C或m6A)。將純化之噬菌體DNA以shotgun cloning搭配primer walking的定序策略,完成 Smp14基因體之定序。噬菌體 Smp14基因體大小為159,910 bp,基因體GC比為54%,推測 Smp14基因體具有20 tRNA基因,230 ORFs,其中70個ORFs與已知功能之蛋白質有同源性,40個ORFs與hypothetical proteins具同源性,其他120 ORFs為Smp14基因體上unique hypothetical genes。Smp14與T4-type噬菌體之結構蛋白相關基因和複製重組相關基因相似,根據 GP23構築之演化樹分析顯示Smp14屬於T4-type噬菌體之新亞群。Smp14基因體具有與核酸生成有關之基因,但未發現與核酸修飾相關之基因。此外, Smp14基因體上推測具有32個由T4-type σ55因子所辨識的晚期啟動子,藉由RT-PCR實驗證明gp4和gp48上游晚期啟動子之功能。於Smp14蛋白質體分析上,N端定序結果顯示 Smp14 GP23經post-translational processing後,產生不同程度修飾之蛋白質。配合蛋白質二維電泳與MALDI-TOF質譜分析,顯示 Smp14 GP23除了經post-translational processing外,亦可能藉由其他修飾作用產生不同分子量及不同pI值之蛋白質群。zh_TW
dc.description.tableofcontents目次 中文摘要 i 英文摘要 ii 目次 iii 表目次 vii 圖目次 viii 縮寫字對照表 x 前言 1 一、 Stenotrophomonas maltophilia 1 二、 噬菌體療法 2 三、 原核生物的病毒-噬菌體 2 四、 T4-like噬菌體 3 五、 噬菌體T4複製機制 4 六、 研究動機 4 材料方法 6 一、 實驗材料 6 (一)菌種、噬菌體及質體 6 (二)藥品 6 (三)引子(primer) 6 (四)抗生素 6 (五)試劑與緩衝溶液 6 1. 抽取質體DNA試劑 6 2. 噬菌體保存液 6 3. 一般DNA電泳試劑 7 4. 脈衝式電泳(pulsed-field gel electrophoresis)試劑 7 5. RNA之抽取純化試劑 7 6. SDS-PAGE電泳試劑 7 7. 二維電泳(2D-electrohoresis)試劑 8 8. 銀染試劑 8 9. 蛋白質N端定序分析樣品準備之試劑 9 二、 實驗方法 9 (一)細菌培養與保存 9 (二)噬菌體篩選 9 (三)噬菌體培養 9 1. 小量噬菌體培養 9 2. 大量噬菌體培養 10 (四)噬菌體純化 10 (五)噬菌體顆粒濃度(titer)測定 10 (六)穿透式電子顯微鏡樣品前處理 10 (七)點測試(spot test) 10 (八)溶菌斑形成分析(plaque assay) 11 (九)溶菌測試(lysis test) 11 (十)生長區線測試 11 (十一)吸附率測試 11 (十二)一步生長區線測試 11 (十三)DNA 製備 11 1. 小量質體DNA製備 11 2. 噬菌體DNA之抽取 12 (十四)洋菜膠電泳分析 12 (十五)脈衝式電泳(Pulsed-field gel electrophoresis;PFGE)分析 12 1. DNA凝膠製備 12 (1)含細菌DNA凝膠製備 12 (2)含噬菌體DNA凝膠製備 13 2. 限制酶切割作用 13 3. 脈衝式電泳 13 (十六)high-performance liquid chromatography(HPLC)分析deoxynucleosides組成 13 (十七)質體選殖 14 1. 噬菌體DNA shotgun處理與DNA片段回收 14 2. DNA黏合作用 14 3. 勝任細胞 (Competent Cell) 之製備 14 4. 轉形作用(Transformation) 14 5. 快速篩選法(Rapid screen) 15 (十八)RNA 製備 15 (十九)反轉錄聚合酶連鎖反應(reverse transcriptase-PCR;RT-PCR) 15 1. 以反轉錄酶製造cDNA 15 2. 聚合酶連鎖反應(RT-PCR) 16 (二十)蛋白質凝膠電泳(SDS – polyacrylamide gel electrophoresis;SDS-PAGE) 16 (二十一)蛋白質N端定序 16 (二十二)蛋白質二維電泳分析(2-D gel electrophoresis) 16 (二十三)蛋白質膠體銀染 17 (二十四)MALDI-TOF 質譜分析 17 (二十五)蛋白質磷酸化分析 17 結果與討論 19 一、Stenotrophomonas maltophilia 溶裂型噬菌體之分離與特性分析 19 (一)S. maltophilia 菌株之基本特性 19 1. 外型 19 2. 最適生長溫度與生長世代(generation time) 19 3. PFGE 分析 19 (二)ΦSMA系列之噬菌體 19 1. 噬菌體之分離與純化 19 2. 噬菌體 ΦSMA2 之外型 20 3. ΦSMA2 之點測試和溶菌斑形成分析 20 4. 宿主範圍(host range) 20 5. ΦSMA2 之限制酶切割圖譜 21 (三)Smp 系列與 ΦSMC 系列之噬菌體 21 1. Smp 系列與 ΦSMC 系列噬菌體之分離與純化 21 2. Smp 系列與 ΦSMC 系列噬菌體之基本特性 21 3. 噬菌體 Smp54 之點測試與溶菌測試 22 4. 噬菌體 Smp54 之限制酶切割圖譜 22 5. Smp54 DNA之形狀 22 6. Smp54 結構蛋白體分析與 major capsid protein 之N端定序 23 7. 超高速離心純化噬菌體 Smp14 23 8. 噬菌體Smp14 與其吸附菌體部位之電顯分析 23 9. 噬菌體 Smp14 之點測試、溶菌斑形成分析與溶菌測試 24 10. 宿主範圍(host range) 24 11. 不同MOI 的噬菌體感染對不同生長期 S. maltophilia 之生長影響 25 12. 最佳噬菌體效價(titer)的獲得 25 13. 噬菌體 Smp14 之穩定性 25 14. 噬菌體 Smp14 之吸附率 25 15. 噬菌體 Smp14 之一步生長曲線(one-step growth curve) 26 16. 噬菌體 Smp14 之基因體大小(genome size)與限制酶切割圖譜 26 17. Smp14 deoxynucleosides 之HPLC 分析 27 二、噬菌體Smp14 之基因體分析 28 (ㄧ)Smp14 基因體定序與初步分析 28 (二)Smp14 基因體之ORFs 組成 28 (三) Smp14 基因體與其他T4-type 噬菌體之基因體相關性 28 (四) Smp14不同類型之基因分析 30 1. 結構基因分佈位置 30 (1)結構基因分佈位置 30 (2)頭部基因比較 31 (3)尾部基因比較 31 (4)尾部纖維基因之推測與分析 32 (5)噬菌體Smp14演化樹分析 32 2. 噬菌體Smp14 之複製、重組和修復基因分析 33 (1)基因分佈位置 33 (2)複製基因群之分析比較 33 (3)重組與修復基因群之分析比較 34 3. 噬菌體Smp14 之轉錄相關基因分析和晚期啟動子預測 34 (1)轉錄相關基因之分析 34 (2)晚期啟動子之預測 35 (3)Smp14晚期啟動子之功能分析 36 4. 噬菌體Smp14 之轉譯作用 37 (1)tRNA 相關基因之分析 37 (2)轉譯抑制因子(translational repressor)之分析 38 5. 噬菌體Smp14 之核酸合成與代謝相關基因分析 39 6. 其他非T4-type 之基因 40 (1)其他噬菌體類型之基因 40 (2)細菌類型之基因 40 三、噬菌體Smp14 之蛋白質體分析 42 (ㄧ)噬菌體 Smp14 之SDS-PAGE 電泳分析與N端定序 42 (二)噬菌體 Smp14 之二維蛋白質電泳分析 42 (三)蛋白質點 MALDI-TOF 質譜分析 42 (四)Smp14 顆粒蛋白之磷酸化測試 45 (五)Smp14 gp23之轉譯蛋白質功能推測 46 參考文獻 49 表目次 表一、本論文所使用之菌種、噬菌體及質體 58 表二、RT-PCR實驗中所使用之引子 60 表三、噬菌體 ΦSMA1到 ΦSMA8 對 8 株 S. maltophilia 進行點測試之感染情形 61 表四、噬菌體 ΦSMA2 對 87 株 S. maltophilia 進行點測試與溶菌斑分析情形 62 表五、噬菌體 Smp54 對 87 株 S. maltophilia 進行點測試與溶菌測試情形 63 表六、噬菌體Smp14對87株S. maltophilia進行點測試、溶菌斑分析與溶菌測試 64 表七、噬菌體 Smp14 感染 87 株 S. maltophilia 之統計 65 表八、Smp14 基因體之基本特性分析 66 表九、噬菌體Smp14 ORFs 之分析比對 67 表十、T4-like噬菌體頭部組成基因比較 78 表十一、T4-like噬菌體之尾部組成基因比較 79 表十二、Smp14基因體中推測的T4-like晚期啟動子類別與下游基因相對位置 80 表十三、噬菌體Smp14 基因體之 tRNA 基因 81 表十四、T4-type噬菌體之major capsid proteins切割位比較 82 表十五、Smp14結構蛋白質MALDI-TOF分析結果 83 表十六、噬菌體 Smp14 與其他 T4-type 噬菌體之基因體特性比較 85 圖目次 圖一、S. maltophilia T14之電顯照片 86 圖二、S. maltophilia T14之生長曲線 87 圖三、S. maltophilia strains之脈衝式電泳分析圖譜 88 圖四、ΦSMA2之電顯照片 89 圖五、噬菌體 ΦSMA2之HaeIII限制酶切割圖譜 90 圖六、Smp系列噬菌體之電顯照片 91 圖七、ΦSMC系列噬菌體之電顯照片 92 圖八、噬菌體顆粒蛋白質之SDS-PAG分析 93 圖九、噬菌體顆粒蛋白質之SDS-PAG分析 94 圖十、噬菌體Smp54之限制酶切割圖譜 95 圖十一、酵素ligase處理或未處理之Smp54 DNA限制酶切割圖譜 96 圖十二、噬菌體Smp54結構蛋白質之SDS-PAG分析 97 圖十三、Smp54 major capsid protein之N端序列比對 98 圖十四、Smp14吸附宿主S. maltophilia strain T14之電顯照片 99 圖十五、S. maltophilia strain T14受 Smp14感染之生長曲線 100 圖十六、Smp14之噬菌體效價 101 圖十七、Smp14感染S. maltophilia strain T14之吸附速率 102 圖十八、Smp14感染S. maltophilia strain T14之一步生長曲線 103 圖十九、Smp14基因體DNA之脈衝式電泳分析 104 圖二十、Smp14基因體DNA經限制酶MseI切割之脈衝式電泳分析圖譜 105 圖二十一、Smp14基因體DNA和質體pOK12 DNA經限制酶切割之電泳分析圖 106 圖二十二、Smp14 deoxynucleosides經HPLC 分離之peaks分析 107 圖二十三、噬菌體Smp14之基因圖譜 108 圖二十四、噬菌體 Smp14與不同T4-subgroup噬菌體之基因體序列相關性 109 圖二十五、噬菌體Smp14與T-evens subgroup噬菌體T4之基因體序列相關性 110 圖二十六、噬菌體Smp14與pseudo-T-evens subgroup噬菌體RB49之基因體序列相關性 111 圖二十七、噬菌體Smp14與schizo-T-evens subgroup噬菌體KVP40之基因體序列相關性 112 圖二十八、噬菌體Smp14與exo-T-evens subgroup噬菌體S-PM2之基因體序列相關性 113 圖二十九、噬菌體T4、KVP40、Smp14與S-PM2之結構基因群相對位置比較圖 114 圖三十、噬菌體T4、KVP40、Smp14與S-PM2之複製重組基因群相對位置比較圖 115 圖三十一、與噬菌體Smp14 major capsid proteins(Gp23)相似蛋白質之演化樹 116 圖三十二、與噬菌體Smp14 major capsid proteins(Gp23)相似蛋白質之演化樹 117 圖三十三、與噬菌體Smp14 tail sheath proteins(Gp18)相似蛋白質之演化樹 118 圖三十四、與噬菌體Smp14 tail tube proteins(Gp19)相似蛋白質之演化樹 119 圖三十五、與噬菌體Smp14 DNA polymerase(Gp43)相似蛋白質之演化樹 120 圖三十六、Smp14基因之RNA表現偵測電泳分析圖 121 圖三十七、 Smp14基因gp4和gp48上游晚期啟動子分析 122 圖三十八、與噬菌體Smp14 lysozyme相似蛋白質之演化樹 123 圖三十九、噬菌體Smp14顆粒蛋白質之SDS-PAG分析 124 圖四十、Smp14顆粒蛋白質之二維蛋白質電泳分析圖 125 圖四十一、噬菌體Smp14顆粒蛋白質之二維蛋白質電泳分析圖 126 圖四十二、噬菌體 Smp14 結構蛋白質經λ-phosphatase 處理與未經處理之二維蛋白電泳分析圖 127 圖四十三、T4 GP23*和T4 GP24*以電腦程式T-COFFEE比對分析圖 128 圖四十四、Smp14 GP23**和T4 GP24*以電腦程式T-COFFEE比對分析圖 129zh_TW
dc.language.isoen_USzh_TW
dc.publisher分子生物學研究所zh_TW
dc.subject噬菌體zh_TW
dc.subjectphageen_US
dc.subject基因體zh_TW
dc.subject蛋白體zh_TW
dc.subjectgenomeen_US
dc.subjectproteomeen_US
dc.titleInvestigation of genome and proteome of Stenotrophomonas maltophilia phage Smp14en_US
dc.titleStenotrophomonas maltophilia噬菌體Smp14的基因體與蛋白體之探討zh_TW
dc.typeThesis and Dissertationzh_TW
item.languageiso639-1en_US-
item.cerifentitytypePublications-
item.grantfulltextnone-
item.openairetypeThesis and Dissertation-
item.openairecristypehttp://purl.org/coar/resource_type/c_18cf-
item.fulltextno fulltext-
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