Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/11455/21297
標題: Xanthan polysaccharide synthesis in xanthomonas campesstrie
十字花科黑腐病菌黃原膠之合成
作者: 林正生
LIN, ZHENG-SHENG
關鍵字: 十字花科;黑腐病菌;黃原膠;葡萄糖;氫基因;選殖
出版社: 分子生物研究所
摘要: 
十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris)會分泌大量的胞外多醣(exopolysac-
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charide),稱之為黃原膠(xanthan polysaccharide 簡稱XPS)。此微生物膠在食品
及工業方面具有很高的應用價值,因而引起本實驗室對其生合成基因研究的興趣。
本實驗室以前曾以亞硝酸(NO﹣)誘變得到百餘株黃原膠合成的突變株。另外,則
利用泛寄生載體pLAFR1及pCP13 建立了兩套基因庫。藉由互補測試,由基因庫中得
到的18個純系(clone) 能將68株突變株補回野生型,所以在這些純系中應該帶有與
胞外多醣合成有關的基因。本研究乃是針對其中的純系pSD701進行分析實驗。
pSD701為一段X. campestris 染色體片段SD701 (5.3 kb)黏接在載體pLAFR1而成的
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重組質體。首先,利用各種鑑識切割SD701 ,建立其鑑識圖譜。其次,將SD701
分段選殖到泛寄主載體pRK415,然後送到XPS 突變株,利用是否保有互補能力來進
行基因定位。因時也利用標誌基因互換的方式,先在SD701 片段上插入抗藥基因,
再送回X. campestris野生型行double cross-over,利用是否會引起突變來定位。
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隨後,進行核酸定序,在所得的序列中發現一個含1,338 bp的Open Reading Frame
(命名為xpsD7 )。足供主導一個帶有445 胺基酸而分子量為48.4 kD 的蛋白質將
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此核酸序列與電腦基因資料庫進行比對,發現和Pseudomonas aeruginosa的algD
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(GDP-甘露醣去氫基因)的核酸序列有47﹪的相似性(similarity),而在胺基
酸序列上亦與其產物有34﹪的同質性(identity)。
為了要了解此基因的轉譯產物,我將其粘接於tac promoter下游,送入maxi-cell
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菌株LCD44 ,並利用IPTG來誘發其大量生產。電泳分析的結果得到一個51 kD 的蛋
白。此一結果和原先從核酸序列推測之蛋白產物的分子量很接近。由於此基因產
物與P. aeruginosa 的GDP-甘露去氫之胺基酸序列很類似,我便以GDP-甘露
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為基質,利用 NAD﹢伴隨還原反應造成OD340 變化來測定其活性,結果發現並無
明顯的反應產生。但以UDP-葡萄醣為基質來進行測試,卻發現有很強的去氫活性,
可知此基因所encode的蛋白應為UDP-葡萄醣去氫。從xpsD7 的胺基酸序列中亦發
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現有廣存於去氫的 NAD﹢結合區域的glycine motif (-G-X-G-X-X-G-) 。此一結
果加強了xpsD7 基因產物為一種去氫的推斷。
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URI: http://hdl.handle.net/11455/21297
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