Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/11455/21570
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dc.contributor.advisor陳全木zh_TW
dc.contributor.advisorChuan-Mu Chenen_US
dc.contributor.author沈志傑zh_TW
dc.contributor.authorShen, Chih-Jieen_US
dc.date2005zh_TW
dc.date.accessioned2014-06-06T07:16:04Z-
dc.date.available2014-06-06T07:16:04Z-
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11455/21570-
dc.description.abstract在哺乳類基因體組中,調控著基因中重要的轉錄訊息而影響基因功能中最主要的因子就是上遺傳性修飾中的DNA甲基化修飾。基因體組上的甲基化修飾模式於已分化的體細胞中是非常穩定且具有可遺傳性的。而在胚胎發育時則有兩個例外的時機點,一個是始基生殖細胞生成的時候,另一個則是合子形成的時候,在這兩個時機點中,其甲基化會經過再程式化的過程,來使得基因體組整體恢復跟親源染色體相同的甲基化模式。銘印基因則是維持胚胎正常生長及發育的重要關鍵,而銘印基因中受甲基化控制之差異性甲基化片段便控制著基因的表現。在利用體細胞核轉置的複製動物中,其胚胎發育有異常、有多發性的器官缺陷、存活率也很低。而存活下來的複製動物個體之銘印基因上的DMR區亦常見有不適當之甲基化修飾,咸認為與銘印基因之異常再程式化有關。在本研究中,利用耳朵纖維母細胞轉置於去核的卵中所產製的四隻複製豬成體為材料,我們利用南方轉漬法、MS-PCR、COBRA、亞硫酸鈉定序等方法來確認在H19、Igf2、Igf2及Ins中的差異性甲基化片段(DMR)是否有甲基化異常。實驗結果顯示在四隻複製豬個體中的四個銘印基因之DMR確有明顯的甲基化異常發生,且好發於各種器官中。本試驗證明了在複製動物成體留存著從胚胎時期即異常之甲基化模式,且推測可能影響其成體後的發育,也可利用本試驗的模式來研究其他複製豬個體,繼續累積足夠的證據來找出核轉置胚存活率低下的關鍵點為何。zh_TW
dc.description.abstractDNA methylation is a major epigenetic modification of the genome that regulates crucial aspects of gene function. Genomic methylation patterns in somatic differentiated cells are generally stable and heritable. However, in mammals there are at least two developmental periods, germ cells and preimplantation embryos, in which methylation patterns are reprogrammed genome wide and generating cells with a broad developmental potential. The recent success of somatic cell cloning in mammals gives promise to applications such as species preservation, livestock propagation , and cell therapy for medical treatment. But cloning by nuclear transfer (NT) has been riddled with difficulties: most clones die before birth and survivors frequently display growth abnormalities. The cross-species similarity in abnormalities observed in cloned fetuses/animals leads us to suspect the fidelity of epigenetic reprogramming of the donor genome. In this study, four cloned pigs created by whole cumulus cell nuclear transfer with short life span and multiple organ defects were used as epigenetic experimental materials, and especially defect in the heart and bone. The Southern blot, methylation-specific PCR, combined bisulfite and restriction assay (COBRA), and bisulfite sequencing were applied to search the aberrant methylation in different imprinted gene loci in these cloned pig genomes. Our data revealed that loss of imprinting (LOI) phenomenon was frequently appeared in H19, Igf2, Ins and Igf2r imprinted loci in several tissues of these cloned sows. These observation indicate that defects in epigenetic inheritance arise very early during clonal development, and that epigenetic information associated with imprinted genes is not faithfully retained in the majority of cloned adults.en_US
dc.description.tableofcontents目錄 封面內頁 簽名頁 授權書……………………………………………………………..I 誌謝……………………………………………………………….II 目錄…………………………………………………………..….III 圖次……………………………………………………………..VII 表次…………………………………………………………….VIII 中文摘要………………………………………………….……..IX 前言……………………………………………………….….......X 壹、文獻檢討 一、DNA甲基化……………….………………………………..1 (一)基因甲基化之熱區………………………...………….1 (二)DNA甲基化和調控基因的關係……………………..2 (三)DNA甲基團轉移酵素………………….……………..4 二、哺乳動物的銘印現象….……………………..……….……5 (一)銘印基因之特徵…………………………………….…5 (二)銘印基因之單一親源染色體表現機制………..….11 1.啟動子上的甲基化………………………….……..12 2.反意DNA的轉錄物……………………….….…...11 3.邊際調控及CTCF蛋白結合區……..………….…14 4.靜默子…………...……………………………..……15 (三)與銘印基因異常有關的人類遺傳疾病…….……..16 (四)銘印基因的功能……………………………………..19 三、基因甲基化異常與癌症的關係…………………………23 四、複製動物及核轉置技術………………………………….27 (一)複製動物的起源………………………….….……...27 (二)核轉置技術………………………………….….……27 (三)核轉置技術的應用………………………….…..…..31 1.遺傳背景相同家畜之產製………………….…..….31 2.產製基因轉殖動物………………………..….……..31 (四)核轉置子代所面臨的問題……………….…………..33 (五)供核細胞與受核卵母細胞之探討…….…………….36 1.供核細胞發育全能性之探討………………….……36 2.細胞質與細胞核間遺傳物質之交互作用…...……37 (六)雄性或雌性基因在胚胎發育過程中扮演之角色….37 (七)再程序化的失控………………..……………………..38 貳、實驗材料與方法 (一)體細胞核轉置產製複製豬個體……………………..42 (二)基因組DNA之抽取…………………………………..42 1.組織基因組DNA之抽取…………………………..42 2.血液基因組DNA之抽取…………………………..43 3.DNA純度之鑑定及定量分析…………….………..44 (三)對照組DNA之甲基化處理…………………………..44 (四)DNA之亞硫酸鈉化學修飾作用……………………..45 (五)選殖CpG island探針………………………………….45 1.聚合酶連鎖反應…………………………………..…46 2.洋菜膠體電泳分析…………………………….…….46 3.DNA接合反應………………………………….……47 4.勝任細胞的製備………………………………..……47 5.細菌的轉型作用……………………………..………47 6.挑含insert之白菌且接種於LB………….….…….49 7.核酸序列分析.………………………………..……..49 8.洋菜膠體中DNA片段之回收…………….……….50 (六)測定CpG island的甲基化情形………………………50 1.甲基化敏感性南方轉漬法……….…………………50 (1)組織DNA之限制酶截切……………………….50 (2)南方轉漬分析……………………………………51 2.MS-PCR之基因甲基化分析…….………………...53 3.COBRA之基因甲基化分析…………….…………..53 4. Bisulfite處理之核酸定序分析……………………54 (七)銘印基因mRNA之分析………………….…………..55 1.萃取組織之total RNA……………..….……….……55 2.半定量反轉錄聚合酶連鎖反應…………..………..55 (1)cDNA轉錄合成………………………..……….55 (2)cDNA增幅反應………………………..……….56 (3)以內部控制組β-actin回歸…………………..57 (八)臨床資料之分析……………………………………….57 参、結果與討論 一、豬隻銘印基因DMR甲基化調控區之 搜尋與比對………………..………..………..……….58 二、南方轉漬法分析H19 DMR的CpG島 於複製豬不同組織之甲基化情形…………….……61 三、南方轉漬法分析Igf2 DMR區的CpG 島於複製豬不同組織之甲基化情形…………....…62 四、南方轉漬法分析Ins DMR區的CpG 島甲基化情形…………………………………………65 五、MS-PCR分析H19 DMR區的CpG島 於複製豬不同組織甲基化情形….………..……….65 六、MS-PCR分析Igf2r DMR區的CpG島 於複製豬不同組織之甲基化情形…………..……..67 七、COBRA分析Ins基因DMR區的CpG 於複製豬不同組織之甲基化情形……...…………..66 八、Ins基因DMR甲基化調控區之亞硫酸 鈉核酸定序……………………….………….…….….70 九、複製豬各種不同組織上的銘印基因異 常甲基化之統計……………………………………...71 十、複製豬出生體重與死亡時的體重之探 討分析……………..……………………………….....76 十一、銘印基因mRNA表現量與其基因之 DMR甲基化之相關性……………..………………..76 肆、結論………………………………………………………….82 伍、參考文獻…………………………………………………….84 陸、英文摘要………………………………………………..…110 作者小傳....................................111 圖次 圖1 DNA甲基化和去甲基化酵素…………………….7 圖2 甲基化銘印現象的生命循環…………..…….....10 圖3 銘印基因的表現機制…………………….………13 圖4 Igf2銘印基因之差異性甲基化片段(DMR) 分別於豬、人類與小鼠不同物種之分佈 情形……………………………………………….60 圖5 南方轉漬法分析H19 DMR區的CpG島甲 基化情形………………………………………….63 圖6 南方轉漬法分析Igf2 DMR區的CpG島甲 基化情形………………………………………….64 圖7 南方轉漬法分析Ins DMR區的CpG島甲 基化情形………………………………………….66 圖8 以MS-pcr分析H19 DNA DMR區的CpG 島甲基化情形……………………..…………….68 圖9 以MS-pcr分析Igf2r DNA DMR區的CpG 島甲基化情形…………………………………...69 圖10 COBRA分析Ins基因啟動子區的CpG島 甲基化情形…………………………………..….72 圖11 Ins基因的亞硫酸鈉定序結果……..…….……..73 圖12 H19、Ins、Igf2、β-actin基因在複製豬2 號和正常對照組豬反轉錄聚合酶連鎖反 應電泳圖與DNA甲基化分析結果比較 圖……...…………………………………………..79 表次 表1 銘印基因的缺失所導致之選擇性疾病.…………18 表2 銘印基因的生化功能……………………..…….…20 表3 體細胞核轉置動物之低產製成功率……………..30 表4 實驗所需引子序列………………………..……..…47 表5 統計圖表分析DNA異常甲基化於複製豬基 因組在銘印基因上的分布情形…...……………..74 表6 複製豬的出生、死亡體重、存活時間及其 死亡主因的資料………………………………..….78zh_TW
dc.language.isoen_USzh_TW
dc.publisher生命科學系zh_TW
dc.subjectimprinting geneen_US
dc.subject銘印基因zh_TW
dc.subjectreprogramming processen_US
dc.subjectepigenetic modificationen_US
dc.subjectcloned swineen_US
dc.subjectnuclear transferen_US
dc.subjectdifferentially methylated regionen_US
dc.subject再程式化作用zh_TW
dc.subject上遺傳性修飾zh_TW
dc.subject複製豬zh_TW
dc.subject核轉置zh_TW
dc.subject差異性甲基化片段zh_TW
dc.title複製豬基因體組中銘印基因上遺傳性修飾異常之研究zh_TW
dc.titleThe Aberrant Epigenetic Modification of Imprinting Genes in Cloned Swine's Genomesen_US
dc.typeThesis and Dissertationzh_TW
item.fulltextno fulltext-
item.languageiso639-1en_US-
item.openairetypeThesis and Dissertation-
item.cerifentitytypePublications-
item.openairecristypehttp://purl.org/coar/resource_type/c_18cf-
item.grantfulltextnone-
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