Streptomyces 表現載體的構築及其應用於 clavulanic acid 之生產

Abstract

本實驗的目的除了建立Streptomyces的轉型系統外，並在Streptomyces中找出具誘導性且為較強勢的啟動子，希望藉此建立一個經濟且高效率的表現系統來大量表現異源性基因，除此之外，也希望將此表現系統應用於clavulanic acid的生合成。將 S. lividans TK64 培養 36 小時，當菌體量達達 0.7 ml/ml PCV (Packed cell volume)時，此種菌體可產生最多量的原生質體，濃度達 2.3×1010 CFU/ml。進行轉形的 DNA 濃度愈高，其轉形效率愈好，而且利用 PEG8000 最適合S. lividans TK64原生質體轉形作用，最高轉形效率可達 5.1×104 transformants/μg DNA。本研究也將 S. lividans TK24的 xlnA 及 xlnB 基因之啟動子區 (promoter region) 選殖於報導基因 (Pseudomonas putida 的 xylE 基因) 的 5 端，在轉形至 E. coli ，利用 1% xylan 或 1mM IPTG 誘導下，發現包含xlnA 基因上游區 600bp 啟動子片段的轉形株 E. coli (pUC-XA) 表現最好，catechol dioxygenase 之比活性達 75U/mg。xlnB 基因之啟動子區，則是包含 xlnB 基因上游區 650bp 啟動子片段帶動xylE基因的表現最佳，E. coli (pUC-XB) 之catechol dioxygenase 比活性達 650U/mg。將這些構築轉形入 S. lividans TK64，於 NMMP broth 內以 1% xylan 誘導，S. lividans (pIJ-XA) 之 xylE 基因表現最好，catechol dioxygease 比活性達 750mU/mg，而 xlnB 啟動子中則以S. lividans (pIJ-XBS) 之xylE 基因的表現最好， catechol dioxygenase 比活性達 200mU/mg。