Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/11455/23938
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dc.contributor.advisor周三和zh_TW
dc.contributor.advisorShan-Ho Chouen_US
dc.contributor.author楊超宇zh_TW
dc.contributor.authorYang, Chao-Yuen_US
dc.contributor.other中興大學zh_TW
dc.date2012zh_TW
dc.date.accessioned2014-06-06T07:21:33Z-
dc.date.available2014-06-06T07:21:33Z-
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11455/23938-
dc.description.abstractc-di-GMP是細菌中一個重要的訊息傳遞分子,參與調控細胞中許多重要的生物功能,包括毒性因子的表達、生物膜的合成以及細胞的運動…等。c-di-GMP的合成主要是由具有GGDEF domains的diguanylate cyclase(DGC)所催化合成的,而它的活性是藉著與其產物(c-di-GMP)結合於其異位抑制區(allosteric inhibitory (I) site)來調控。然而卻有一大部分的GGDEF domains欠缺了與c-di-GMP結合的異位調控區之高保留序列RxxD。在本研究中,我們利用X-ray的晶體繞射技術解析了Xanthomonas campestris DGC之GGDEF domain XCC4471GGDEF與c-di-GMP之複合體結構。觀察此複合體之三度空間結構,我們驚訝地發現兩分子XCC4471GGDEF藉著與兩分子c-di-GMP結合於高保留活性區而相互連結形成二聚體。在此複合體結構中,(c-di-GMP)2採取一種前所未見的部分地相互穿插之形式,座落於兩個面對面的XCC4471GGDEF中央,其外圍兩個guanine bases結合於guanine-binding pockets,而中心兩個guanine bases則相互堆疊。利用單點突變的方式,改變XCC4471GGDEF中參與c-di-GMP專一結合的胺基酸,都會導致其與c-di-GMP結合能力顯著下降。另外,至今數以萬計的GGDEF domains中,這些胺基酸都是高度保留的。以上這些結果顯示了GGDEF蛋白結合(c-di-GMP)2於活性區的一個新的product-bound模式。此嶄新的XCC4471GGDEF-c-di-GMP複合體結構或許可以提供一個普遍模型,幫助我們針對X. campestris或者是其它也具有多種GGDEF蛋白的微生物,設計能夠阻斷DGC活性之藥物前驅物。zh_TW
dc.description.abstractc-di-GMP is a key signalling molecule involved in regulating many important biological functions in bacteria. The synthesis of c-di-GMP is catalyzed by the GGDEF-domain-containing diguanylate cyclase (DGC), the activity of which is regulated by the binding of product at the allosteric inhibitory (I) site. However, a significant number of GGDEF domains lack the RxxD motif characteristic of the allosteric I site. Here, the structure of XCC4471GGDEF, the GGDEF domain of a DGC from Xanthomonas campestris, in complex with c-di-GMP has been solved. Unexpectedly, the structure of the complex revealed a GGDEF-domain dimer cross-linked by two molecules of c-di-GMP at the strongly conserved active sites. In the complex (c-di-GMP)2 adopts a novel partially intercalated form, with the peripheral guanine bases bound to the guanine-binding pockets and the two central bases stacked upon each other. Alteration of the residues involved in specific binding to c-di-GMP led to dramatically reduced KD values between XCC4471GGDEF and c-di-GMP. In addition, these key residues are strongly conserved among the many thousands of GGDEF-domain sequences identified to date. These results indicate a new product-bound form for GGDEF-domain containing proteins obtained via (c-di-GMP)2 binding at the active site. This novel XCC4471GGDEF-c-di-GMP complex structure may serve as a general model for the design of lead compounds to block the DGC activity of GGDEF-domain containing proteins in X. campestris or other microorganisms that contain multiple GGDEF-domain proteins.en_US
dc.description.tableofcontents誌 謝 I 中文摘要 II Abstract III 表目次 VII 圖目次 VIII 縮寫檢索表 IIX 第一章、前言 1 第二章、材料與方法 6 一、蛋白質表現載體之構築 6 (一) 引子的設計 6 (二) 染色體DNA之抽取 7 (三) 聚合酶連鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR) 7 (四) 膠體電泳 (gel electrophoresis) 8 (五) 基因之萃取 8 (六) 質體DNA之抽取 8 (七) Ligation-Independent cloning(LIC) 9 (八) E. coli勝任細胞之製備 10 (九) 轉殖作用(Transformation) 11 (十) DNA定序 11 二、定點突變(Site-Directed Mutagenesis) 13 三、蛋白質之大量表現與純化 13 (一) 蛋白質之大量表現 15 1. Native蛋白之製備 15 2. Selenium標定蛋白質之製備 15 (二) 以Ni-CAM親和性管柱純化目標蛋白 15 (三) 使用凝膠過濾法純化目標蛋白 16 (四) 蛋白濃度之測定 17 四、利用X-ray晶體繞射技術解析蛋白質之三級結構 17 (一) 蛋白質結晶實驗 17 (二) 結晶條件篩選 (crystallization condition screening) 18 (三) 蛋白質與ligand的共結晶 (co-crystallization) 19 (四) 避免晶體損壞 (crystals damage) 19 (六) 繞射數據收集 (diffraction data collection) 20 (七) 決定相位角 20 1. 同形取代法 20 2. 異常散射法 21 3. 分子置換法 21 (八) 結構的建立 (model building) 與精算 (refinement) 22 五、XCC4471蛋白之活性分析 23 六、XCC4471蛋白之生物物理測量(biophysical measurements) 23 (一) 恆溫滴定微卡計實驗(ITC, isothermal titration calorimetry) 24 (二) 分析型超高速離心實驗(analytical ultracentrifugation) 25 第三章、結果與討論 26 一、XCC4471表現載體之構築、蛋白質表現及純化 26 二、XCC447169~301為HAMP-GGDEF蛋白且保有DGC活性 27 三、XCC4471GGDEF-c-di-GMP複合體之結晶實驗與結構解析 28 四、XCC4471GGDEF(128~291)-c-di-GMP複合體之晶體結構 30 五、XCC4471GGDEF中許多高保留的胺基酸參與c-di-GMP結合 31 六、比較已發表的c-di-GMP結構顯示XCC4471GGDEF-c-di-GMP複合體中之(c-di-GMP)2為一全新構形 33 七、突變型XCC4471GGDEF與c-di-GMP結合力變化與XCC4471GGDEF-c-di-GMP晶體結構相吻合 35 八、c-di-GMP穩定了XCC4471GGDEF二聚體 36 第四章、結論 37 附錄一 實驗材料 68 表目錄 表一、XCC4471GGDEF(69-301) 在不同濃度c-di-GMP存在下之酵素動力參數 42 表二、XCC4471GGDEF(128–291)–c-di-GMP complex之繞射數據及結構精算 43 表三、野生型XCC4471GGDEF(69–301)、XCC4471GGDEF(128–291) 及其突變型蛋白與c-di-GMP之ITC測量結果 44 圖目錄 圖1. c-di-GMP之代謝與訊息傳遞途徑 45 圖2. 蛋白質表現載體與LIC表現載體之設計 46 圖3. Ligation-Independent Cloning (LIC) 構築表現載體示意簡圖 47 圖4. 氣相擴散法 48 圖5. 以SDS-PAGE觀察XCC4471蛋白的大量表現與純化 49 圖6. 凝膠過濾管柱之標準曲線 50 圖7. XCC4471GGDEF(128-291)蛋白之凝膠過濾法純化的層析圖與SDS-PAGE圖 51 圖8. Helix bundle組合排列與Xcc中GGDEF蛋白的HAMP domain序列比對 52 圖9. XCC4471蛋白質序列以及domain組成 53 圖10. 使用pyrophosphate assay方法測量DGC活性與抑制情形 54 圖11. XCC4471、PleD、WspR與MqR89a之GGDEF domains序列比對 55 圖12. XCC4471GGDEF(128-291)蛋白與c-di-GMP的晶體 56 圖13. XCC4471GGDEF(128~291)-c-di-GMP二聚體之立體圖 57 圖14. GGDEF domains之三級結構重疊圖 58 圖15. XCC4471GGDEF(128~291)-c-di-GMP二聚體之電荷分布圖 59 圖16. Xcc中二十三個GGDEF domains胺基酸之保留性 60 圖17. XCC4471GGDEF(128~291)-c-di-GMP複合體之活性區立體圖 61 圖18. XCC4471GGDEF(128~291)-c-di-GMP複合體之活性區立體圖 62 圖19. LIGPLOT圖畫呈現GGDEF-c-di-GMP複合體之鍵結原子與鍵結長度 63 圖20. (c-di-GMP)2之電子密度圖與構形 64 圖21. 野生型以及單點突變型XCC4471之ITC測量結果 65 圖22. 野生型XCC4471GGDEF(128~291)之AUC測量結果 66 圖23. 野生型XCC4471GGDEF(69~301)之AUC測量結果 67zh_TW
dc.language.isoen_USzh_TW
dc.publisher生物化學研究所zh_TW
dc.subjectXanthomonas campestrisen_US
dc.subject十字花科黑腐病菌zh_TW
dc.subjectdiguanylate cyclaseen_US
dc.subjectc-di-GMPen_US
dc.subject鳥甘酸環化酶zh_TW
dc.subject環狀二鳥甘酸zh_TW
dc.titleXanthomonas campestris之GGDEF蛋白XCC4471與c-di-GMP複合體的結構解析與diguanylate cyclase活性分析zh_TW
dc.titleThe structure and inhibition of a GGDEF diguanylate cyclase complexed with (c-di-GMP)2 at the active siteen_US
dc.typeThesis and Dissertationzh_TW
item.languageiso639-1en_US-
item.openairetypeThesis and Dissertation-
item.cerifentitytypePublications-
item.grantfulltextnone-
item.fulltextno fulltext-
item.openairecristypehttp://purl.org/coar/resource_type/c_18cf-
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