一. 豬胰臟膽固醇脂�奶坐u業化生產及麟臨床檢驗套組之製備 二. 沙門式桿菌基因探針之選殖

Abstract

本研究之目的，在利用肉品加工廠廢棄物豬胰製備膽固醇酯，探討其工業化生產之 條件、方法及配製膽固醇檢驗套組，以供臨床膽固醇檢驗套組製備之用。本報告採用 三種方法進行此酵素之製備。方法一，係依據lABOW （１３）等人所述方法，結果由 粗酵素液到Sephadex G-２００管柱層析步驟，當以PNPA 為基質時，酵素回收率為１ ４．３％，比活性提高３．６９倍，若以cholesterol acetate 為基質時，則回收率 幾乎為零，而比活性降低甚鉅，同時不能應用到檢驗套組之製備。其原因為：①膽鹽 為酵素活性所必須；②可能凝乳胰蛋白於純化過程中活化，水解膽固醇酯活性測 定之基質，方法並不可靠。 方法二概述如下．由２５g豬胰臟丙酮粉末依Hernandez⑽等人所述方法，收集３０∼ ６０硫酸銨沈澱區分，添加５mg／ml膽鹽進行透析，再經３３％酒精去除沉澱及冷凍 乾燥後可得１．５g 酵素粉末，比活性提高０．４８倍，回收率為２０．０％，由此 方法所得之酵素粉末，可應用於膽固醇檢驗套組之製備，這些套組在２５℃下，可經 ８小時放置；或４℃下一週以上之放置；其活性不變，相當穩定。並且套組在２５℃ 下，可經８小時放置；或４℃下一週以上之放置；其活性不變，相當穩定。並且套組 中鹽濃度以添加１５mg／ml，酵素濃度在０．５mg／ml（７５units ／l ），可得最 佳之反應活性。 方法三為上述方法二之改進，適合工業化生產；由２０g 胰臟丙酮粉末經含硫酸銨及 膽鹽溶液萃取豬胰臟膽固醇酯，再經添加大豆蛋白抑制劑及PMSF（phenyl meth- yl sulfonyl fluoride）於酵素液中，經隔夜透析，冷凍乾燥可得４．２２g 酵素粉 末，比活性未見提高，回收率２５．１％，由此酵素製備之膽固醇套組，其穩定度、 可靠度合乎要求。 本研究之目的，乃在尋找沙門氏桿菌特異性純係（clone ），以應用到食品沙門氏桿 菌污染之快速檢驗上。由S.typhimurium染色體DNA，經限制Bam HI切割完全後，回收 ４．１kb及４．９kb附近之DNA片段，再分別與pUC１３及YEp１３ 載驗黏接，經轉形 作用後，分別由１０１（以pUC １３當載體）及１９２個（以YEp 當載體）轉形細胞 中，選拔到６４個Lac 及１９個Ap Tc 轉形細胞，最後以限制Bam HI和Eco RI分 別進行切割，分析其DNA大小，其中共有５個純系，可能插入S.gyphimurium４．１kb 或４．９kb特異性DNA片段。需經進一步與大腸桿菌，沙門氏桿菌及其他細菌等作DNA 雜交試驗才能確定。