Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/11455/5135
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dc.contributor.advisor林伯雄zh_TW
dc.contributor.advisorLin Po-Hsiungen_US
dc.contributor.author盧秀卿zh_TW
dc.contributor.authorLu, Hsiu-Chingen_US
dc.date2005zh_TW
dc.date.accessioned2014-06-06T06:34:06Z-
dc.date.available2014-06-06T06:34:06Z-
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11455/5135-
dc.description.abstract本研究係利用生物性指標分析方法,針對雌性激素之醌類化物與蛋白質所形成共價鍵結產物-蛋白質胼合物,作為推估雌性激素之醌類化物於標的器官之組織劑量。本研究建立一衍生方法,以TFAA (trifluoroacttic acid anhydride) 作為衍生劑,在強酸環境下催化,將雌性激素之醌類化物與蛋白質上之Cysteine之硫原子鍵結產生之胼合物,自蛋白質結構中移除,並經由溶劑萃取濃縮,再利用氣相層析電子撞擊與負離子化學離子化質譜儀 (GC/EI/MS及GC/NICI/MS),進行定性與定量分析。同時利用同位素內標準品,完成對雌性激素醌類化物(estrone-2,3-quinone) 與cysteine形成之胼合物之同分異構物之定性結構確認,並針對雌性激素醌類化物與cysteine及蛋白質形成之胼合物之分析方法進行反應條件最佳化測試。此外運用高效能液相層析儀純化雌性激素之醌類化物之cysteine胼合物,作為定量所需檢量線之標準品。並針對BSA (Bovine serum albumin) 和人類血清白蛋白 (human serum albumin) 之背景值,以及人類乳癌細胞株 (MCF-7 cells/MDA-MB-231 cells),對於雌性激素醌類化物之蛋白質胼合物之背景值進行偵測,並確認雌性激素可於乳癌細胞中代謝活化形成醌類化物並進而與細胞內之蛋白質上之cysteine形成胼合物。實驗結果顯示於人類及小牛血清白蛋白,偵測到4-OHE2-2-Y及2-OHE2-4-Y之生成,對於E1蛋白質胼合物亦具有相似之結果此一結果顯示雌性激素能代謝活生成具活性之醌類化物並能進而與蛋白質反應形成穩定之蛋白質胼合物。對於乳癌細胞MDA-MB-231及MCF-7細胞之分析結果顯示,4-OHE2-2-Y及2-OHE2-4-Y皆存在於此二細胞株內,但並未發現E1醌類化物之蛋白質胼合物。zh_TW
dc.description.abstractThe objective of this research is to develop a biochemical assay using protein adducts as biomarker of exposure to assess the cumulative body burden of estrogen-derived quinones in target organs. This method ultilizes trifluoroacetic acid (TFAA) and methanesulfonic acid (MSA) as catalysts to cleave cysteinyl adducts of estrogen-derived quinones on proteins. The cleaved adducts are recovered by organic solvent extractions and analyzed by gas chromatography-electron-impact/negative-ion-chemical-ionization-mass spectrometer (GC-EI-MS/GC-NICI-MS). The isomeric forms of cysteinyl adducts of estrogen-2,3-quinones (2-OHE2) are characterized by using isotopically-labelled bound internal standards after adducts cleavage by the TFAA/MSA derivatization procedure. Additionally, we optimized the method by modifying the derivatization procedure to recover the estrogen quinone-derived cysteinyl adducts on proteins. Additionally, synthetic cysteinyl adducts of estrogen quinones were further purified by HPLC-UV and were used as standards to quantify the modified proteins. We applied this derivatization method to analyze the background levels of cysteinyl adducts of estrogen quinones on bovine serum albumin and human serum albumin. Further, we measured the cysteinyl adducts of estrogen quinones on total cellular proteins derived from human breast cancer cells MCF-7 and MDA-MB-231. Results confirmed that E2 was converted to estrogen quinones which subsequently bind to cellular proteins in human breast cnacer cells. The background levels of cysteinyl adducts of estrogen quinones, including 4-OHE2(E1)-2-Y and 2-OHE2(E1)-4-Y, were detected in human and bovine serum albumin. In addition, we detected the presence of 4-OHE2-2-Y and 2-OHE2-4-Y adducts in the total cellular proteins derived from human breast cancer cells MDA-MB-231 and MCF-7 whereas 4-OHE1-2-Y and 2-OHE1-4-Y were not detected. Overall, results from our investigation confirmed the presence of estrogen-2,3 and -3,4-quinones in human and bovine serum albumin and in the cellular proteins derived from human breast cancer cells.en_US
dc.description.tableofcontents目 錄 摘 要 I Abstract II 縮寫表 (List of Abbreviation) IV 目 錄 VI 表 目 錄 IX 圖 目 錄 X 圖 目 錄 X 第一章 前言 1 1-1 研究緣起 1 1-2 研究目的 2 第二章 文獻回顧 3 2-1 雌性激素 3 2-2-1 物理化學特性 3 2-2-2 環境中的雌性激素 5 2-2 雌性激素的代謝及致癌機制 6 2-2-1 雌性激素之代謝機制 6 2-2-2 雌性激素其代謝物之致癌機轉 9 2-2-3 雌性激素代謝與核酸損壞相關基因多行性之研究 12 2-2-4 雌性代謝物之去解毒機制 15 2-2-5 雌性激素干擾物質之作用機制 16 2-2-6 雌性激素代謝物對人體之影響 17 2-2-7 雌性激素代謝物對乳癌細胞之影響 20 2-2-8 雌性激素與其代謝物分析方法 20 2-3 蛋白質胼合物作為生物指標 22 2-3-1 生物指標 22 2-3-2 蛋白質併合物的偵測方法 23 2-3-3 DNA adducts 與Protein adducts的差別 26 第三章 實驗材料及方法 28 3-1 實驗材料 28 3-1-1 化學藥品及耗材 28 3-1-2 實驗設備 28 3-2 實驗方法 29 3-2-1 2/4-OHE-N-acetyl-L-Cysteine Adducts之製備 29 3-2-2 E1/E2-N-acetyl-L-Cysteine Adducts製備 30 3-2-3 E1/E2-BSA Adducts製備 31 3-2-4 17β-Estradiol-2, 4, 16, 16, 17-d5製備其醌類代謝物及與BSA之合成 32 3-2-5 TFAA derivatization分析方法 33 3-3 氣相層析質譜儀分析條件 34 3-4 以HPLC純化E2-NAC Adducts之條件 37 3-5 分析驗證之程序 38 3-5-1 檢量線 38 3-5-2 偵測極限 38 3-6 TFAA derivatization分析方法之運用 39 3-6-1 TFAA derivatization方法之最佳化 39 3-6-2 雌性激素於人體乳癌細胞內之代謝活化與胼合物之生成 40 3-6-3 人類血清白蛋白透析 40 3-6-4 人類與小牛之血清白蛋白之雌性激素背景值偵測 41 第四章 實驗結果 42 4-1 雌性激素醌類衍生物與N-acetyl-L-cysteine生成adduct之定性圖譜 42 4-1-1 E2-NAC adducts之定性圖譜 42 4-1-2 E1-NAC adduct 之定性圖譜 44 4-1-3 內標準品 (Equilienin) 46 4-1-4 同位素內標準品 (E2-d5-BSA) 46 4-2 TFAA derivatization反應條件之探討 49 4-2-1 反應時間與溫度之影響 49 4-2-2 TFAA與MSA用量之影響 49 4-2-3 反應程序不同對反應效果之影響 50 4-3 HPLC標準品之取得及檢量線製作 51 4-4 背景值之偵測 51 4-4-1 蛋白質背景值偵測 51 4-4-2 乳癌細胞株雌性激素蛋白質胼合物背景值偵測 53 第五章 討論 84 5-1 定性用離子之評估與選擇 84 5-2 TFAA derivatization衍生方法最佳化之探討 85 5-3 定性方面質譜之比對 86 5-4 雌性激素 (E1, E2) 於人類與小牛血清白蛋白及乳癌細胞中背景值偵測之探討 90 第六章 結論與建議 91 6-1 結論 91 6-2 未來研究方向與建議 92 第七章 文獻回顧 93 表 目 錄 表 2.1 類固醇荷爾蒙之物化特性 4 表 2.2 四個已開發國家其河川中雌性激素之濃度 5 表 2.3 CYP1A1、CYP1B1及COMT對乳癌風險與人種之間的基因多型性 14 表 2.4 正常婦女雌性激素血清中之濃度 19 表 2.5 更年期婦女血清中雌性激素之濃度 19 表 2.6 蛋白質胼合物分析方法 23 表 2.7 比較TFAA 與Alkaline permethylation衍生方法之不同點 25 表 2.8 哺乳類動物血液中大分子化合物之含量及其生命週期 27 表 3.1 GC/EI/MS之分析條件 35 表 3.2 GC/NICI/MS之分析條件 36 表 3.3 HPLC-UV之流洗條件 37 表 3.4 HPLC 分析儀器之型號 38 表 5.1 E2-NAC與E2-d5-BSA兩者間離子相互貢獻之情況 85 表 5.2 雌性激素蛋白質胼合物之斷片分子量整理 (GC/EI/MS) 88 表 5.3 雌性激素蛋白質胼合物之斷片分子量整理 (GC/NICI/MS)。 89 圖 目 錄 圖 1.1 研究設計之架構圖 2 圖 2.2 雌性激素主要代謝之途徑 8 圖 2.3 雌性激素致癌模式 10 圖 2.4 雌性激素代謝的去活化路徑和DNA結合物形成 11 圖 2.5 雌性激素代謝氧化與去解毒機制 16 圖 3.1 Fremy’s salt 化學結構圖 29 圖 3.2 4-OHE-derived NAC adducts 之化學結構圖 31 圖 3.3 glutathione與雌性激素鍵結形成之胼合物 32 圖 3.4 TFAA derivatization分析方法之示意圖 33 圖 4.1 E2-d5與BSA反應鍵結其硫基後經由TFAA衍生之示意圖 48 圖 4.2 4-OHE2-2-NAC之質譜圖及全掃描層析圖,(a) GC/EI/MS total ion chromatography (TIC);(b) GC/EI/MS 之全掃描質譜圖,滯留時間為54.79 min;(c) GC/NICI/MS之全掃描質譜圖。 56 圖 4.3 2-OHE2-1-NAC之質譜圖及全掃描層析圖,(a) GC/EI/MS total ion chromatography (TIC);(b) 全幅掃描質譜圖,滯留時間為55.82 min;(c) GC/NICI/MS 全幅掃描質譜圖。 57 圖 4.4 承圖4.3,2-OHE2-4-NAC之全掃描質譜圖,(a) GC/EI/MS全幅掃描質譜圖,滯留時間為58.23 min;(b) GC/NICI/MS 全幅掃描質譜圖。 58 圖 4.5 承圖4.3與圖4.2,4-OHE2-2-NAC、2-OHE2-4-NAC及2-OHE2-1-NAC經TFAA衍生之17-hydroxyl之產物。(a) 滯留時間為56.53 min為2-OHE2-1-NAC;(b) 滯留時間為59.09 min為2-OHE2-4-NAC;(c) 滯留時間為57.20 min為4-OHE2-2-NAC。 59 圖 4.6 E2-NAC之層析圖及全掃描質譜圖,(a) GC/NICI/MS total ion chromatography (TIC);(b) 全掃描質譜圖,滯留時間為54.41 min為2-OHE2-1-NAC。 60 圖 4.7 承圖4.6,E2-NAC之層析圖及全掃描質譜圖,(a) 全掃描質譜圖,滯留時間為54.08 min 為4-OHE2-2-NAC;(b) 全掃描質譜圖,滯留時間為54.15 min為2-OHE2-4-NAC。 61 圖 4.8 4-OHE1-2-NAC之層析圖及全掃描質譜圖,(a) GC/EI/MS total ion chromatography (TIC);(b) GC/EI/MS全幅掃描質譜圖滯留時間為54.52 min;(c) GC/NICI/MS 全幅掃描質譜圖滯留時間為54.61 min。 62 圖 4.9 E1-NAC之層析圖及全掃描質譜圖,(a) GC/NICI/MS total ion chromatography (TIC);(b) GC/NICI/MS全掃描質譜圖,滯留時間為53.31 min為2-OHE1-1-NAC。 63 圖 4.10 承圖4.9,E1-NAC之全掃描質譜圖,(a) 滯留時間為54.41 min 為4-OHE1-2-NAC;(b) 滯留時間為54.48 min為2-OHE1-4-NAC。 64 圖 4.11 E1-BSA之層析圖及全掃描質譜圖,(a) GC/NICI/MS total ion chromatography (TIC);(b) GC/NICI/MS全掃描質譜圖,滯留時間為52.84 min為2-OHE1-1-BSA。 65 圖 4.12 承圖4.11,E1-BSA之全掃描質譜圖,(a) GC/NICI/MS全掃描質譜圖,滯留時間為53.38 min為4-OHE1-2-BSA;(b) GC/NICI/MS全掃描質譜圖,滯留時間為53.46 min為2-OHE1-4-BSA。 66 圖 4.13 Equilenin之層析圖及全掃描質譜圖,(a) GC/EI/MS total ion chromatography (TIC);(b) GC/EI/MS全掃描質譜圖,滯留時間為54.72 min為Equilenin;(c) GC/EI/MS全掃描質譜圖。 67 圖 4.14 E2-d5-BSA之層析圖及全掃描質譜圖,(a) GC/NICI/MS total ion chromatography (TIC);(b) GC/NICI/MS全掃描質譜圖。 68 圖 4.15 承圖4.14 ,E2-d5-BSA之層析圖及全掃描質譜圖,(a) GC/NICI/MS全掃描質譜圖,滯留時間為56.42 min為4-OHE2-2-d5-BSA;(b) GC/NICI/MS全掃描質譜圖,滯留時間為56.53 min為2-OHE2-4-d5-BSA。 69 圖 4.16 TFAA derivatization分析分析程序最佳化對NAC adducts,探討不同反應時間與溫度之影響。 (a) 反應溫度為110℃; (b) 反應溫度為100℃; (c) 反應溫度為80 ℃; (b) 反應溫度為60℃。 70 圖 4.17 TFAA derivatization分析程序對於E1-NAC adduct之最佳化,探討不同TFAA與MSA劑量之影響。其中N-acetyl-l-cysteine (3 mg) 與E1 (3 mM) 反應30 min再進行TFAA derivatization。反應溫度為110℃,反應時間為90 min。 71 圖 4.18 TFAA derivatization分析程序對於E2-BSA最佳化探討TFAA與MSA之加入於分析樣本之時間點。 72 圖 4.19 TFAA derivatization分析程序對於E1-BSA與E2-BSA探討TFAA酸解蛋白質時間與MSA催化蛋白質時間。 73 圖 4.20 TFAA derivatization分析方法程序對於E1-BSA與E2-BSA探討TFAA與MSA參與反應之時間點。 74 圖 4.21 4-OHE2-2-NAC於HPLC-UV之層析圖。4-OHE2經由MnO2氧化後與NAC鍵結,形成4-OHE2-NAC蛋白質胼合,而後經由HPLC-UV進行分析,UV為292 nm,採梯度流洗之方式,分段收集。 75 圖 4.22 TFAA derivatization adduct of 4-OHE2-2-N-acetyl-cysteine 之莫耳數與波鋒面積比值之檢量線關係。 75 圖 4.23 人類血清白蛋白 (10 mg) (自Sigma購得)之雌性激素E2蛋白質胼合物背景值偵測。以GC/NICI/MS採取SIM模式偵測所得背景E2-Q-adducts之TIC圖譜(a)與同位素內標準品 (E2-d5-BSA) 之TIC圖譜(b)(c)。 76 圖 4.24 人類血清白蛋白 (10 mg) (自行透析) 之雌性激素E2蛋白質胼合物背景值偵測。以GC/NICI/MS採取SIM模式偵測,(a) 背景值之TIC圖譜;(b)(c) 同位素內標準品 (E2-d5-BSA) 之TIC圖譜。 77 圖 4.25 小牛血清白蛋白 (10 mg)(Sigma所購得) 之雌性激素E2蛋白質胼合物背景值偵測。以GC/NICI/MS採取SIM模式偵測,(a)背景值之TIC圖譜;(b)(c) 同位素內標準品 (E2-d5-BSA) 之TIC圖譜。 78 圖 4.26 人類血清白蛋白 (10 mg) (自sigma購得)之雌性激素E1蛋白質胼合物背景值偵測。以GC/NICI/MS採取SIM模式分析,(a) 偵測E1-Q-adducts之TIC圖譜;(b) 實驗組所添加之同位素內標準品之TIC圖譜;(c) 對照組標準品E1-NAC之TIC圖譜;(d) 對照組同位素標準品E2-d5-BSA之TIC圖譜。 79 圖 4.27 人類血清白蛋白 (10 mg) (自行透析)之雌性激素E1蛋白質胼合物背景值偵測。以GC/NICI/MS採取SIM模式分析,(a) 偵測E1-Q-adducts之TIC圖譜;(b) 反應物中所添加之同位素內標準品之TIC圖譜;(c) 對照組標準品E1-NAC之TIC圖譜;(d) 對照組同位素標準品E2-d5-BSA之TIC圖譜。 80 圖 4.28 小牛血清白蛋白 (10 mg) (自sigma購得)之雌性激素E1蛋白質胼合物背景值偵測。以GC/NICI/MS採取SIM模式分析,(a) 偵測E1-Q-adducts之TIC圖譜;(b) 反應物中所添加之同位素內標準品之TIC圖譜;(c) 對照組標準品E1-NAC之TIC圖譜;(d) 對照組同位素標準品E2-d5-BSA之TIC圖譜。 81 圖 4.29 MCF-7乳癌細胞約10 mg之雌性激素蛋白質胼合物背景值偵測。以GC/NICI/MS採取SIM模式偵測所得背景E2-Q-adducts之TIC圖譜(a)與同位素內標準品 (E2-d5-BSA) 之TIC圖譜(b)(c)。 82 圖 4.30 MDA-MB-231乳癌細胞約10 mg之雌性激素蛋白質胼合物背景值偵測。(a) 空白組之TIC 圖譜;(b) E2-Q-adducts之TIC圖譜;(c)(d) 同位素內標準品 (E2-d5-BSA) 之TIC圖譜。 83zh_TW
dc.language.isoen_USzh_TW
dc.publisher環境工程學系zh_TW
dc.subjectprotein adducten_US
dc.subject蛋白質胼合物zh_TW
dc.subjectestrogenen_US
dc.subject雌性激素zh_TW
dc.title發展一生物化學法分析雌性激素蛋白質胼合物zh_TW
dc.titleDevelopment of a Biochemical Assay to Analyze the Protein Adducts of Estrogen Quinonesen_US
dc.typeThesis and Dissertationzh_TW
item.openairecristypehttp://purl.org/coar/resource_type/c_18cf-
item.openairetypeThesis and Dissertation-
item.cerifentitytypePublications-
item.fulltextno fulltext-
item.languageiso639-1en_US-
item.grantfulltextnone-
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