Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/11455/51681
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dc.contributor.advisor葉娟美zh_TW
dc.contributor.advisorChuan-Mei Yehen_US
dc.contributor.author劉錦峰zh_TW
dc.contributor.authorLiu, Chin-Fengen_US
dc.date2004zh_TW
dc.date.accessioned2014-06-06T08:54:41Z-
dc.date.available2014-06-06T08:54:41Z-
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11455/51681-
dc.description.abstractThe antimicrobial peptide nisin belongs to the family of lantibiotics and is produced by several strains of Lactococcus lactis. Lactic acid bacteria (LAB) have been used for centuries in the preparation and processing of foods, beverages and animal feed due to its food-grade status. In this study, We aimed to develop a food-grade expression system in lactic acid bacteriaby taking advantage of the nisin immunity (nisI) and nisin resistance (nsr) gene from L. lactis BCRC10791, BCRC14016 and pFM011, respectively instead of using the common antibiotic resistance genes as selection markers. In previous study, we had chemically synthesized a promoter derived from B. subtilis veg promoter. A hagp Up element consensus -35 (TTGACA) and -10 (TATAAT) hexamers, and a TG motif were designed to construct the expression signals. In order to analysis the function of the expression signals, gusA was used as a reporter gene. Functional analysis of expression signals showed that the fusion of endogenous gusA to an artificial σA-type promoter constitutively expressed in Lactococcus lactis NZ9000; however, lower GusA activities was found for Lactobacillus paracasei BCRC14023. The secretable reporter levanase (sacC) controlled by the artificial σA-type promoter is able to be expressed extracellularly in L. lactis NZ9000 and Lb. paracasei BCRC14023. To develop a new selection system for lactic acid bacteria, the food grade selection markers, nisI and nsr were amplified from L.lactis BCRC10791 as well as BCRC14016 and from pFM011 by PCR. The amplified product were then cloned into pET29a and pHAσAGus and transformed into B.subtilis DB104. Both nisI and nsr gene elevated the nisin resistance level in Bacillus subtilis DB104. From the nisin tolerance tests of L. lactis NZ9000 and Lb. paracasei BCRC14023, 50 IU and 500 IU nisin concentrations was chosen for food grade vecter selection in L. lactis NZ9000 and Lb. paracasei BCRC14023, respectively. Food grade vector with nsr gene enhances the nisin tolerance of L. lactis NZ9000 and Lb. paracasei BCRC14023 efficiently. Food grade vector with nisI gene are not so effective, maybe due to the low expression level.en_US
dc.description.abstract乳酸鏈球菌素 (nisin)為Lactococcus lactis 所生產,屬於抑菌胜,為FDA所認可之食品添加劑,常應用於醱酵食品之添加,藉以提高產品的保存期限,而乳酸菌屬於食品級之菌株,長期應用於醱酵食品、乳品及動物飼料之製造上。於本研究中以nisin抗性基因nisin immunity (nisI)及nisin resistance (nsr)基因,作為食品級篩選標記,取代遺傳工程中常用之抗藥性篩選模式,以建立乳酸菌食品級表現系統,進一步改善抗生素濫用而造成環境及生物上之危害。 本實驗室先前設計與改造枯草桿菌veg啟動子,並利用重疊延展聚合酶連鎖反應合成此改造之σA-type啟動子,其-10區域由原先TACAAT改為TATAAT,-16區域導入TG motif,由於該-10與-35區域與乳酸菌之共識序列相同,故進行其於乳酸菌中之功能性測試。在表現元件之測試上,以本實驗室合成之σA型啟動子融合胞內gusA報導基因,並於乳酸菌中觀察其表現情形,結果顯示L. lactis NZ9000中GusA之活性隨著培養時間之增加而增加,可進行持續表現,而Lactobacillus paracasei BCRC 14023則是集中於對數生長前期,後期之表現與控制組相差無幾。另一胞外分泌性蛋白質SacC表現可分泌至胞外,但表現量不大。食品級大腸桿菌-乳酸菌穿梭載體之構築方面,在食品級抗性基因(nisI)之選殖上,以nisin生產株L. lactis subsp. lactis BCRC 10791以及BCRC 14016皆可順利增幅該基因,另自載體pFM011上增幅食品級nisin抗性基因(nsr),初步在Bacillus subtilis DB104宿主顯示其具抗nisin效果。乳酸菌宿主對於nisin之耐受度測試結果顯示,L. lactis NZ9000與Lb. paracasei BCRC 14023分別在50 IU及500 IU之nisin濃度下具有抑制效果,故以此濃度作為遺傳工程之篩選濃度,所建構之帶有nsr基因之食品級載體,於L. lactis NZ9000及Lb. paracasei BCRC 14023均可有效的提升菌體對於nisin耐受之程度。帶有nisI之質體,抗性較差,可能因其表現量較低所致。zh_TW
dc.description.tableofcontents內容目錄 頁次 中文摘要………………………………………………………………….. i 英文摘要………………………………………………………………….. ii 壹、前言…………………………………………………………………… 1 貳、實驗目的……………………………………………………………… 28 參、實驗策略……………………………………………………………… 29 肆、材料與方法…………………………………………………………… 31 一、菌種與質體……………………………………………………… 31 二、藥品與試劑……………………………………………………… 36 三、質體DNA抽取方法………..…………………………………… 36 四、質體之確認……………………………………………………… 38 五、枯草桿菌染色體DNA抽取方法……………………………….. 38 六、乳酸菌染色體DNA抽取方法………………………………….. 39 七、電勝任細胞之製備及電轉形條件……………………………… 40 八、利用PCR反應增幅載體構築元件及其相關PCR增幅條件……. 42 九、PCR產物之回收………………………………………………… 44 十、自膠體回收DNA片段…………………………………………… 47 十一、DNA分子之補齊 (Fill in)……………………………………. 47 十二、DNA分子間之黏合作用……………………………………... 47 十三、大腸桿菌-乳酸菌穿梭載體之建構…………………………... 47 十四、食品級抗性基因次選殖及建構……………………………… 48 十五、乳酸菌表現載體及食品級表現載體之建構…………………. 49 十六、報導基因活性測定……………………………………………. 50 十七、蛋白質特性分析……………………………………………… 51 十八、枯草桿菌來源之levanase-histag純化………………………… 51 十九、食品級抗性基因功能性測試………………………………… 53 二十、乳酸菌宿主對nisin之耐受度試驗…………………………… 53 二十一、以西方墨漬法偵測SacC於乳酸菌中之表現情形………… 53 伍、結果與討論…………………………………………………………… 55 一、人工合成表現元件於乳酸菌中之功能性測試…….…………… 55 二、乳酸菌穿梭載體之建構…………………………..……………… 59 三、分泌性蛋白質SacC基因之增幅及表現載體之建構…………… 59 四、食品級抗性基因之選殖及其應用於食品級表現載體之建構....... 78 陸、結論………………………………………………………………….. 97 柒、參考文獻…………………………………………………………….. 98 捌、附錄………………………………………………………………….. 115 附錄一、傳統質體DNA抽取方法…………………………………… 115 附錄二、利用快速套組抽取質體DNA方法…………………………. 118 附錄三、染色體DNA抽取方法…………………………………….. 120 附錄四、電轉形方法…………………………………………………. 122 附錄五、純nisin貯存液製備………………………………………… 126 附錄六、抗生素貯存溶液配製及各實驗各菌株所使用之抗生素量.. 127 附錄七、藥品與儀器………………………………………………….. 128 圖目錄 頁數 圖一、nisin A、Z及Q胺基酸序列……………………………………….. 10 圖二、nisin基因群組………….…………………………………………. 12 圖三、nisin與lipidII結合造成孔洞形成之情形……………………….. 13 圖四、nisin生合成之調控…………………….…………………………. 14 圖五、nisin抗性基因 (nsr)之核酸序列及胺基酸序列……..…………... 17 圖六、質體複製形式……………………………………………………... 19 圖七、人工合成σA type啟動子序列…………………………………… 27 圖八、以pHY300PLK為基礎所建構之nisI及nsr表現載體……………. 35 圖九、pNZter及pNZGUS簡圖…………………………………………. 56 圖十、表現元件於L. lactis NZ9000之功能性測試…………………… 57 圖十一、表現元件於Lb. paracasei BCRC14023之功能性測試………… 58 圖十二、p177以不同限制酶確認之電泳分析圖……………………….. 60 圖十三、p177質體構築流程圖………………………………………….. 61 圖十四、p177pL2以不同限制酶確認之電泳分析圖…………………….. 62 圖十五、p177 pL2質體構築流程圖……………………………………… 63 圖十六、sacC與sacCH於不同煉合溫度下之PCR反應結果…………. 65 圖十七、pET29aSacC載體構築流程圖…………………………………. 66 圖十八、pET29aSacCH載體構築流程圖………………………………. 67 圖十九、來自B. subtilis DB104之sacC核酸及胺基酸序列…………… 70 圖二十、E.coli BL21 (DE3)/pET29aSacC及pET29aSacCH以1mM IPTG誘導蛋白質表現之情形…………………………………. 71 圖二十一、SacCH以Ni-NTA純化結果………………………………… 72 圖二十二、(A) E. coli BL21 (DE3)/pET29aSacC於Inulin-RBB/LA透明環產生情形 (B) Inulin-RBB之鍵結結構…………………………………... 73 圖二十三、pNZSacCfil載體構築流程圖…………………………..……. 74 圖二十四、pNZSacCfil質體圖譜…………………………………..……. 75 圖二十五、表現載體pNZSacCfil於L. lactis NZ9000表現情形………. 76 圖二十六、表現載體pNZSacCfil於Lb. paracasei BCRC14023表現情形…………………………………………………….………. 77 圖二十七、乳酸菌nisin生產株染色體DNA抽取結果………………… 79 圖二十八、cnisF及cnisR引子以聚合酶鏈鎖反應增幅nisin生產株nisI之結果………………………………………………………… 80 圖二十九、pET29anisI載體構築流程圖…………………………………. 81 圖三十、E.coli BL21 (DE3)/pET29nisI以1mM IPTG誘導蛋白質表現情形…………………………………………………………….. 82 圖三十一、L. lactis BCRC14016及BCRC10791之nisI核酸及胺基酸序列………………………………………………………….. 83 圖三十二、pET29anisIter載體構築流程圖………………………………. 84 圖三十三、pHAσAnisIter載體構築流程圖……………………………. 85 圖三十四、pHAσAOSnisIter載體構築流程圖…………………………. 86 圖三十五、pHYNSR載體構築流程圖……………….…………………. 88 圖三十六、nisin抗性基因於B. subtilis DB104中之功能性測試……… 89 圖三十七、以不同nisin濃度測試L. lactis NZ9000宿主之耐受度……. 91 圖三十八、以不同nisin濃度測試Lb. paracasei BCRC14023宿主之耐受度………………………………………………………… 92 圖三十九、pFNSacCfil質體構築流程圖………………………………… 93 圖四十、pFNSacCfil以不同限制酶確認之電泳分析圖…………………. 94 圖四十一、以不同nisin濃度測試L. lactis NZ9000/pFNSacCfil之耐受度…………………………………………………………….. 95 圖四十二、以不同nisin濃度測試Lb. paracasei BCRC14023/ pFNSacCfil之耐受度………………………………………... 96 表目錄 頁數 表一、應用於醱酵乳製品之主要乳酸菌屬…………………………….. 2 表二、目前美國食品藥物管理局認定是安全之菌株………………….. 3 表三、乳酸菌所生產之抑菌種類……………………………………… 5 表四、革蘭氏陽性菌所生產之細菌素分類…………………………….. 7 表五、乳酸菌nisin生產菌株……………………………………………. 9 表六、於乳酸菌中表現異源蛋白質之研究實例……………………… 22 表七、L. lactis轉錄起始區序列………………………………………….. 24 表八、Lactobacillus轉錄起始區序列…………………………………… 25 表九、Lactococci之轉譯起始區序列………………………………….. 26 表十、實驗中所操作之菌株…………………………………………… 31 表十一、實驗中所運用之質體………………………………………… 32 表十二、實驗中所運用之引子及其序列………………….…………… 45 表十三、各個元件之PCR反應條件…………………………………….. 13-1 依DyNAzyme EXTTM 13-2 依TaKaRa Ex TaqTM 46 表十四、抗生素貯存溶液配製………………………………………… 127 表十五、主要操作菌株抗生素使用量對照表………………………… 127zh_TW
dc.language.isoen_USzh_TW
dc.publisher食品科學系zh_TW
dc.subjectfood-grade expression systemen_US
dc.subject食品級表現系統zh_TW
dc.subjectlactic acid bacteriaen_US
dc.subjectnisinen_US
dc.subjectnisIen_US
dc.subjectnisin resistance (nsr)en_US
dc.subjectreporter geneen_US
dc.subjectartificial expression signalsen_US
dc.subject乳酸菌zh_TW
dc.subject乳酸鏈球菌素zh_TW
dc.subjectnisin抗性基因zh_TW
dc.subject食品級表現載體zh_TW
dc.subject報導基因zh_TW
dc.subject人工合成表現元件zh_TW
dc.titleDevelopment of food-grade expression system to express heterologous proteins in Lactic acid bacteriaen_US
dc.title開發乳酸菌食品級表現系統以應用於異源蛋白質之表現zh_TW
dc.typeThesis and Dissertationzh_TW
item.cerifentitytypePublications-
item.openairecristypehttp://purl.org/coar/resource_type/c_18cf-
item.languageiso639-1en_US-
item.fulltextno fulltext-
item.grantfulltextnone-
item.openairetypeThesis and Dissertation-
Appears in Collections:食品暨應用生物科技學系
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