Expression of phytase in Bacillus subtilis EE1 and Lactobacillus paracasei

Abstract

植酸為植物體內磷主要儲存形式，研究指出植酸若無法有效地被動物水解與利用，則會衍生出環境汙染問題或是形成抗營養因子。植酸酶能夠水解植酸並釋出無機磷、myo-inositol與一些衍生物。本研究擬選殖出枯草桿菌之植酸酶基因，以trypsin cutting site作為linker，將植酸酶基因融合於α-澱粉酶基因之後，形成α-澱粉酶-植酸酶融合基因，將融合基因選殖至Escherichia coli - Bacillus subtilis穿梭載體pHY300PLK中，構築出含有α-澱粉酶-植酸酶融合基因之表現質體 pHAP。利用電轉形方法，將表現質體 pHAP轉形至 Bacillus subtilis EE1中，探討α-澱粉酶-植酸酶融合蛋白質之表現情形。此外，將植酸酶基因與乳酸菌Plac啟動子進行基因層次上的融合，並選殖至乳酸菌質體 pNZ3004中，建構出含有Plac-植酸酶之表現質體 pNZP，再轉形至 Lactobacillus paracasei中，進而研究其表現情形。 利用蛋白質電泳分析融合蛋白質於枯草桿菌中之表現情形，結果顯示在胞內或胞外之蛋白質中，於融合蛋白質預期之分子量位置無明顯之預期條帶出現。酵素活性分析結果顯示，於胞外可測得α-澱粉酶活性，且酵素活性在菌體培養24小時後可達最高，但植酸酶活性則未被偵測到。此外與植酸酶融合之α-澱粉酶活性較未經融合之α-澱粉酶低。推測蛋白質融合方式可能影響酵素之摺疊及構形，進而影響酵素活性。此外在建構Plac-植酸酶基因之表現載體過程中，經核苷酸序列定序結果發現，Plac 核苷酸序列在-35區域發生變異，核苷酸序列由TTGCGT改變為CTGCGT，目前已將此產生變異之表現質體轉形至L. paracasei中，並觀察植酸酶之表現情形。