Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/11455/52189
標題: Physiological Role of the Putative Pyrimidine Reductive Catabolism Pathway in Brevibacillus agri and Change of the Substrate Specificity of the Dihydropyrimidinase for Chiral (I)
嘧啶還原代謝途徑 Brevibacillus agri 的生理角色及改變dihydropyrimidinase 之基質選擇性以應用於不對稱化合物之生產(I)
作者: 許文輝
關鍵字: 生物科學類;應用研究;Dihydropyrimidine dehydrogenase;dihydropyrimidinase;£]-alanine synthase;Brevibacillus agri NCHU1002;L-N-carbamoylase;D,L-homophenylalanylhydantoin;L-homophenylalanine
摘要: 
嘧啶還原代謝途徑包含了三個酵素的催化反應,第一個步驟是 dihydropyrimidine dehydrogenase 的催化反應,此反應在哺乳動物中是嘧啶降解過程中的一個速率決定步驟,利用 NADPH 為還原劑,將 uracil 及 thymine 分別水解成 dihydrouracil 及 dihydrothymine,再經由第二個酵素 dihydropyrimidinase 進行開環反應 將 dihydrouracil 及 dihydrothymine 水解成 N-carbamoyl-β-alanine 及 N-carbamoyl-β-aminoisobutyric acid,最後再經由 β-alanine synthase 的作用,生成 β-alanine 及 β-aminoisobutyric acid,ammonia 和二氧化碳。近年來在很多的研究中也證實了嘧啶的還原代謝過程在某些微生物及動物組織中是必須的,因為 uracil 經由此一還原代謝途徑所產生的終產物 β-alanine 是合成 pantothenic acid 及 coenzyme A 的主要成份,並且在哺乳動物中此一代謝途徑是合成神經傳導物質 β-alanine 及 β-aminoisobutyric acid 的唯一途徑。 本實驗室已由 B. agri 中選殖到一段約 8.2 kb 的 DNA 片段,經過序列比對及初步酵素的活性分析結果,顯示此序列上包含了可能參與嘧啶還原代謝途徑的三個基因,並分別命名為 pydA (dihydropyrimidine dehydrogenase)、pydB (dihydropyrimidinase) 及 pydC (β-alanine synthase),其中,pydB 及 pydC 之基因產物的生化特性已確立,pydBC operon 的表現與調控也有初步的瞭解,這些研究成果已發表於 Biochemical and Biophysical Research Communications 303 (2003) 848-854。搜尋已發表的研究報告及微生物基因體序列,未曾發現其他微生物具有此基因串,尤其在同屬於 Bacillus 菌屬的 B. subtilis 及 B. halodurans 的基因體序列中,也不具有此.與嘧啶還原代謝基因的存在。因此,有必要對 B. agri 特有的嘧啶還原代謝基因串進行深入研究,以瞭解其真正的生理功能及角色。研究其基因的調控,有助於篩選系統的建立,俾進行以嘧啶類似物為主要結構的藥物開發,並可建立一個模式可利用生體外的分析,了解藥物的代謝命運及其解毒的功能。除此之外,在先前的研究中,發現 B. agri 的 dihydropyrimidinase 具有 D-hydantoinase 之活性,惟對於基質 (D,L-homophenylalanylhydantoin,以下簡稱 D,L-HPAH) 的催化是屬於非鏡面選擇性的。亦即,利用此 dihydropyrimidinase 搭配本研究室由 B. kaustophilus 選殖出來的耐熱性 L-N-carbamoylase 可將基質 D,L-HPAH 轉換成 L-homophenylalanine (L-HPA)。L-HPA 是合成許多血管緊縮素轉換酵素抑制劑的前驅物,在全世界的藥品市場佔有非常重要的地位。惟B. agri dihydropyrimidinase 的基質選擇性趨向 D-HPAH,轉換 L-HPAH 的速率相當差 (初步的實驗結果顯示,其效率只有5﹪),若能加以改造使其偏向 L-HPAH,非常有工業化應用之可行性。特別是這兩個酵素都是熱穩定型的酵素,可以克服基質 (D,L-HPAH) 因溶解度低而必須在高溫下進行酵素轉換的問題。經過人工改造的 dihydropyrimidinase 配合 L-N-carbamoylase 的催化,可利用個別基因或融合兩酵素之基因的方式,在同一宿主內表現,以轉形細胞進行生物轉換生產 L-HPA,是值得嘗試的新方法。酵素的人工改造及生物轉換法生產不對稱化合物 HPA,在基礎及應用科技領域上都有相當大的價值及原創性。因此,未來三年,本計畫將進行下列工作: 第一年度 1. 完成 B. agri dihydropyrimidine dehydrogenase 酵素的純化及生化性質分析。 2. 分析 pydA 基因的啟動子以及在不同培養條件下基因的表現及調控。 3. 建立 B. agri 質體轉形系統。 4. 分析 dihydropyrimidinase 3-D 結構 (此部份將與清大生科系王雯靜教授合作執行)。 第二年度 1. 篩選高轉形效率的 B. agri 突變株並建立其轉形系統。 2. 以基因重組的方式破壞 pyd 基因,分析 pyd 基因在生理上所扮演的角色。 3. 利用 Error-prone PCR、DNA shuffling 及定點突變等方法改造 B. agri dihydropyrimidinase 的酵素性質,提升其對 L-HPAH 的基質選擇性及催化能力。 4. 分析 dihydropyrimidinase 的3-D 結構。 第三年度 1. 完成 dihydropyrimidinase 酵素的改造,使其更適合 L-HPAH 之轉換。 2. 分析變異 dihydropyrimidinase 的3-D結構。 3. 將改造的 dihydropyrimidinase 基因及 B. kaustophilus 的 L-N-carbamoylase 基因構築在同一宿主細胞,以個別基因或融合酵素基因的方式進行基因表現,利用轉形細胞進行生物轉換來生產 L-HPA。
URI: http://hdl.handle.net/11455/52189
其他識別: NSC93-2311-B005-013
Appears in Collections:分子生物學研究所

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