Mutational Analysis of X. campestris Beta-Lactamase

Abstract

許多 Xanthomonas 的病原小種具有抗 ampicillin 的特性。目前本實驗室已定出X.campestris pv. campestris 11 (Xc11)、 X. campestris pv. campestris 17 (Xc17) 及 X.campestris pv. campestris 85 (Xc85) 之 β-lactamase 基因 bla 和正調控 β-lactamase 表現的 ampR 基因之序列。定序結果顯示這三個strains 的AmpR 胺基酸序列完全相同，β-lactamase 胺基酸序列非常相似，差異僅為第7 與第206 胺基酸位置。然而Xc11、Xc17、Xc85 之β-lactamase 活性，以及對各抗生素抗藥性皆有不同。此結果很可能是由於β-lactamase 胺基酸序列差異所致，但也可能是由於菌株背景不同。為了瞭解 Xanthomonas bla 與ampR 基因序列的差異對 β-lactamase 表現量以及與基質專一性之間的關係，本計畫擬分成四個項目探討。 1. 先利用 PCR 擴增Xc11、Xc17與Xc85 菌株 bla-ampR 區域之 DNA 片段，構築於相同載體，轉殖送入 Xc11 blaxcc-1mutant 與 Xc11 ampR1 mutant 中，分析在相同背景下，序列的差異對 β-lactamase 表現量及抗生素基質專一性的影響。 2. 針對Xc11、Xc17 與Xc85 的 Bla 間具有差異之第7與第206 個胺基酸位置進行定點突變。由於第7 個胺基酸位於 signal peptide，將利用Western blot 偵測比較wild type 與第7 個胺基酸突變的mutants 之細胞質與胞質週緣區Bla 蛋白之表現量與活性。 結果可以對signal peptide 與 β-lactamase 表現量及比活性的關係提供更直接的證據，目前這方面之探討與瞭解並不多。 3. 為了找出其他會影響Xc11 β-lactamase 比活性與基質專一性的胺基酸，擬利用random mutagenesis 方法，得到抗生素基質MIC 增加之突變株。 經定序後，針對這些胺基酸進行定點突變分析。 4.將active site 內第136 個胺基酸Ser，第172 個胺基酸Glu 突變為其他性質不同之胺基酸後，測試突變株β-lactamase 的比活性與對各抗生素抗性。 結果除了可以確認active site內的此兩個胺基酸對水解外來抗生素之重要性外，亦可用以與上述構築之突變株活性加以比較。這些實驗將對class A β-lactamase 之胺基酸序列與功能有更清楚之瞭解。