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標題: Mutation Analysis of the Catalytic Site of the D-Amino Acid Oxidase from Trigonopsis variabilis
利用突變技術分析Trigonopsis variabilis D-Amino Acidoxidase的催化位置
作者: 許文輝
關鍵字: 應用研究;D-amino acid oxidase;生物技術;D型胺基酸氧化?;頭孢菌素C;基因表現;蛋白質工程;酵母菌;Cephalosporin C;Gene expression;Protein engineering;Yeast
摘要: 
D-型胺基酸氧化酵素 (D-amino acid oxidase,以下簡稱 DAO)屬於flavoenzyme,此種酵素可催化 D-型胺基酸的氧化脫氨反應 (oxidativedeamination),產生氨及 α-型酮酸 (α-keto acid)。DAO脢廣泛存在於各種不同的微生物及動物組織內。DAO 能將 Cephalosporin C (CephC)轉變成 7-β-(5-carboxy-5-oxopentanamido)-cephalosporanic acid(keto-AD-7ACA),隨後 keto-AD-7ACA 再與 H2O2 發生自然反應,產生7-β-(4-carboxybutanamido)-cephalosporanic acid (GL-7ACA),GL-7-ACA 可由GL-7ACA acylase 再轉變成 7-amino-cephalosporanic acid (7-ACA),而 7ACA 是cepham 類抗生素的precursor。目前利用化學法生產過程太複雜,因此,利用酵素法提高 7-ACA的產量,以降低 cepham 類抗生素的生產成本,是較好的選擇。在所有的微生物當中,就目前所知,酵母菌 Trigonopsis variabilis 的 DAO 對Ceph C 有最好的轉換能力。將 dao cDNA 基因選殖至表現載體 pQE30,再轉型入 E.coli JM109,以 T5 啟動子控制其表現,在 IPTG 誘導之下,其比活性為 5.5U/mg,且 dao 基因於 E. coli JM109 表現時,轉型菌株生長良好。目前已能大量純化DAO 脢,且抗體已製備完成。此外,將 dao 基因構築在 M13mp19上,利用定點突變法,將 DAO 上的 His-324 分別改變為 Leu-324,Glu-324,Arg-324及 Tyr-324,發現 Leu-324 及 Arg-324 突變株已不具有 DAO 活性,顯示 His-324的胺基酸側鏈在 DAO 的催化活性方面扮演了重要角色。而將 DAO 上所有的methionine 均改變成 leucine;位於親水性區域的 cysteine 改變成alanine,結果發現 Met-156、Met-209 之突變均使酵素的催化活性提高為野生型的1.2 至 2倍,因此,需要進一步以酵素動力學分析 Met-156 及 Met-209在酵素催化反應中所扮演的角色。
URI: http://hdl.handle.net/11455/52466
其他識別: NSC86-2311-B005-010
Appears in Collections:分子生物學研究所

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