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標題: Mutational Analysis of the Feedback-Resistant Prephenate Dehydratase from Corynebacterium glutamicum (III)
酵素工技研究-突變法分析Corynebacterium glutamicum具有迴饋抗性的Prephenate Dehydratase(III)
作者: 許文輝
關鍵字: 基礎研究;Site directed mutagenesis;生物技術;定位突變;迴饋抑制;基因表現;麩胺酸;棒狀桿菌;酵素動力學;Feedback inhibition;Gene expression;Glutamate;Corynebacteria;Enzyme kinetics;Prephenate dehydratase
摘要: 
苯丙胺酸 (Phenylalanine) 是人體所須之必需胺基酸,近年來由於人工甜味料Aspartame 的發展成功,使得其前驅體 -- 苯丙胺酸之需求量激增,1992 年的需求量達到 8,800 公噸,其發展未可限量。苯丙胺酸可以用發酵法或酵素轉換法生產,惟酵素轉換法之成本較高。因此日本及美國均利用糖質原料醱酵生產苯丙胺酸,所使用的菌株為使用的菌株為基因重組的生產菌。然而,截至目前為止,對於苯丙胺酸生合成的一些關鍵性酵素的性質,例如:迴饋抑制位置仍未有深入的了解。申請人已發展成功 E. coli-coryneform bacteria 之穿梭載體,並建立利用電轉形法,將質體高效率轉形入 coryneform bacteria ,也利用個人建立之基因選殖系統,由Corynebacterium glutamium 選殖出笨丙胺酸生合成最具關鍵性之 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase 基因【簡稱 DAHP synthase 基因,本報告已發表於 EEMS Microbiol. Lett. 107:223-230. (1993)】及 prephenate dehydratase基因。本計畫的目的在於深入了解 prephenate dehydratase 的迴饋抑制作用位置,以便將來能利用人為的方法,完全解除 prephenate dehydratase的迴饋抑制現象,以提昇菌體對苯丙胺酸之產率 (productivity) 及收率 (yield)。在第一年度及第二年度的工作,發現 prephenate dehydratase 的 C 端的 Arg-202及 Gly-224,對迴饋抑制反應的解除,非常重要,若將 Gly-224 改變時,往往會使酵素完全解除 phenylalanine 的迴饋抑制現象。研究數據亦顯示,Gly-224可能是位於 phenylalanine 結合位置的入口處。(研究成果已投稿 Biochem. Biophys.Res. Comm. 如附件)本年度的工作目標如下:1.利用選位突變法 (site-directed mutagenesis) 修改 prephenate dehydratase 的Arg-202,以了解其在迴饋抑制作用的角色。2.利用 6X His-tagged 方法回收及純化各種 mutant prephenate dehydratase ,以便進行 enzyme kinetics 分析。3.測定 mutant prephenate dehydratase 的 kinetic properties。
URI: http://hdl.handle.net/11455/52468
其他識別: NSC86-2316-B005-002
Appears in Collections:分子生物學研究所

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