豬精子性特異蛋白之特性研究與應用-抗體製備與功能定性研究

Abstract

預選子代性別之相關生物技術具有鉅大之產業經濟價值。迄今尚無有效、方便且安全分離XY 精子之方法可以用來早期擇選子代性別。利用X-及Y-精子細胞膜蛋白之差異則可發展出成本低、準確性高、侵害性低及易操作之免疫篩選法；但相關報告極微。本實驗室應用Ohno』s law，以哺乳動物之性特異性蛋白(sex-specific membrane proteins,SSMPs) 較其他non-SSMPs 在演化上具高度保留性為基礎理論，進行X、Y 精子表面特異性蛋白(SSMPs) 篩選，以期做為X、Y 精子分離之基準。先以豬精子細胞膜蛋白作為抗原，進行雌雄兔性別差異免疫法以產生相對應抗體。再利用酵素連結免疫吸附分析法(ELISA) 監測抗體揚升，之後分別以雌雄兔產生的抗體對豬精子細胞膜蛋白進行西方墨點法(Western blotting) 分析。接續應用雌雄兔產生的抗體製備性別特異性親和管柱，通入豬精子細胞膜蛋白，進行性特異性蛋白之純化，共進行三次的純化步驟。初步純化之SSMPs 經一維電泳分析於分子量13.6 及72.2 kD 處可見特異蛋白(n=3)。進一步運用高解析度之二維電泳(two-dimensional electrophoresis) 配合西方墨點法嘗試偵測出相關SSMPs，結果雄兔抗體能成功辨識出經純化三次之特異X 精子表面抗原（分子量約102 kDa）。應用親和性管柱一次純化後所得到的蛋白質經過二維泳及鍍銀染色後，發現在公兔抗體管柱部份偵測到40 個點，母兔抗體管柱則有84 個點，其中又有20 個蛋白點是具重覆性的。進一步比對結果發現在公兔抗體管柱得到的蛋白質有10 個點是母兔抗體管柱所未存化出的，同樣的在由母兔抗體所得到的蛋白質有15 個點是公兔抗體管柱沒有的。接續利用質譜儀MALDI-TOF MS 來進行蛋白質身份鑑定。公兔抗體管柱所得到的蛋白質中進行了7 個點的分析，有一個點是hemoglobulin；母兔抗體管柱方面分析了27 個點得到hemoglobulin、myoglobulin、heat shock protein、ATP synthetase。總計有29 個點不存在於資料庫，而這未些辨識出之點可能為未被發現之精子性特異蛋白(NSC 93-2313-B-005-068 project report)。本次計劃於第一年度將進一步進行SSMPs 胺基酸序列分析(N-terminus 及LC MS/MS) 並生產抗合成胺基酸之抗血清；第二年將進行抗血清對預選子代性別效果之評估。相關研究將為免疫法篩選X 及Y 精子之可行性提供了正面的成果；後續技術的研究及開發則深具臨床醫學應用價值。