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標題: The Study of Global Genome Methylation Profile in Embryonic Stem Cell Differentiation Using Mouse CpG Islands Methylation Microarray (I)
利用小鼠甲基化基因晶片剖析胚幹細胞於體外分化之機制(I)
作者: 陳全木
關鍵字: 基礎研究;生物技術, 畜牧獸醫類
摘要: 
哺乳動物基因體上普遍存在於基因啟動子至exon1 區域之一群由富含CG 所組成之特殊序列稱之為CpG islands。位於CpG islands 上不正常的DNA甲基化作用已知為癌細胞中常見之上遺傳性(epigenetic)變異因子,其影響之層面包括腫瘤抑制因子(tumor-suppressor genes) 之基因靜默作用(genesilencing)、以及與染色體穩定性、細胞週期調控及DNA 修補系統相關基因之轉錄活性喪失。基因之甲基化作用亦與X-染色體之去活化作用、生殖細胞之基因銘印系統(gene imprinting system)以及胚胎發育與胚層分化息息相關;胚胎發育之過程與許多遺傳疾病及癌症生成之機制,皆牽涉到細胞分化及細胞增生之微妙平衡關係。目前已發現有少許甲基化關聯性之發育基因亦證實為引發癌症及先天性疾病之導因,諸如Prader-Willi 與Angelman 症候群以及 Wilms 氏腫瘤等,此等甲基化基因也成為新的診斷標誌與基因治療標的藥物。新近之研究報告亦發現,若將細胞內維持正常基因甲基化修飾作用的三套甲基轉化.(DNA methyltransferases; 分別為Dnmt-1, -3a,與-3b)逐次進行基因剔除後,會導致胚幹細胞(embryonic stem cells)產生基因體低度甲基化現象、染色體不穩定性(chromosome instability)的增加、甚且喪失胚幹細胞體外分化之能力以及形成胚體(embryoid bodies)之多分化潛能;顯然,胚幹細胞於體內或體外之細胞分化機制,均受到上遺傳性(epigenetic)的基因甲基化修飾作用而有所影響。迄今已有多種基因甲基化之研究方法,如MS-PCR、MS-SNuPE、COBRA 與Bisulfite 核酸定序法等可供分析一特定基因之甲基化程度,然無法同時進行多個甲基化基因座之解析;新近開發之CpG island基因晶片技術則提供一廣面及快速之基因篩選工作。因此,本研究之初期目標係著手小鼠甲基化基因晶片之研發,於小鼠胚幹細胞體外分化過成中具差異性展現之甲基化關聯性基因群,進行一基因體組之全面性篩選,以及建立該等基因在定向分化成不同胚層組織之時空上表現的縱剖面。更長遠之目標則期待進一步釐清基因甲基化修飾作用對於胚幹細胞分化可能之調控機制。本計畫擬分三年逐步完成:第一年之重點係著重於小鼠甲基化基因晶片之開發,與小鼠胚幹細胞之體外純株培養系統,並測試此一新穎性基因晶片之點製與雜合效率;第二年之重點則針對小鼠胚幹細胞株之定向分化系統之建立及各個不同分化階段具差異性展現之甲基化關聯性基因群進行基因晶片之廣面性篩選,cDNA 選殖與定序並分析其於胚幹細胞體外與體內發育之時空表現;第三年之重點則著重於甲基化基因群之功能性探討,包括選殖cDNA 之體外轉錄系統(in vitro transcription)、Morpholino antisense 合成以及RNAi 系統之建立,進行胚幹細胞電轉殖與囊胚顯微注射之基因表達障阻試驗,探討該等基因於胚幹細胞體外與體內分化所扮演之功能與角色。
URI: http://hdl.handle.net/11455/52823
其他識別: NSC94-2313-B005-048
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