The Structural and Functional Studies of the Interaction between the Host Proteins and the 3'UTR of Classical Swine Fever Virus RNA

Abstract

豬瘟，又稱豬霍亂，是由豬瘟病毒所引起的一種高度敗血症傳染性疾病，以嚴重的全身性出血為主癥，感染率與死亡率均高達95%，是國際公認的豬隻重要傳染病。兔化豬瘟疫苗屬於馴化活毒疫苗對豬隻即具有高度安全性且具高度免疫力。為了瞭解強毒株(ALD)與弱毒株(LPC)之間的遺傳變異上的關係，我們進行LPC 與ALD 的序列比對，結果發現兩者序列之間的確有些許的差異，這個差異主要位於3′端非轉譯區上，LPC 弱毒株比ALD 強毒株多出了13 個核.酸 (CUUUUUUCUUUUU) ，這多出的序列是否可能就是兩者之間主要的差異點將成為整個計劃的主軸。由先導試驗得知，這個只在LPC3′UTR 出現的序列位於SLIII 的loop 區域，而且經由UV-crosslinking 與immuno-precipitation 的實驗得知有至少六個蛋白質能與3′UTR 進行結合，而其中polypyrimidine-tract binding protein 則可能只針對LPC 這段多出來的序列進行專一性的連結。為探求這段序列及這些與3′UTR 結合蛋白質的功能，我們將以in vitro translation的系統來證實這些蛋白質與3′UTR 所結合的可能性功能，並同時建立in vivo translation的系統，其中將以luciferase gene 來取代部份豬瘟的轉譯序列並觀察luciferase gene 的表現。我們也將在第二年計畫中建立一個在細胞中可以偵測複製效率(replicon)的系統。同時將用Heparin-Sepharose column 與Q-column 來分離與純化這些蛋白質，並將些個蛋白質以LC/MS/MS 來定序。最後在第三年的計畫中將以replicon 為基礎，建構一系列在3′UTR 的突變株，證實那些核酸片段及序列具有與複製相關的cis-acting elements。